lamp引物设计入门

选中Nucleotide在此处输入需要查找的信息LAMP引物设计简介第一部分，如何查找序列首先，登录NCBI(美国国立生物技术信息中心)的网站，网址，查找我们所需要的序列，具体操作如下：点开NCBI的主页，点开AllDatebases，选中下拉菜单中的Nucleotide，然后在右边对话框中输入我们所需要查找的物种的拉丁名以及基因的英文名称。比如说我要查找大肠杆菌的16SrDNA的序列，那么只需要将大肠杆菌的拉丁名Escherichiacoli以及16SrDNA输入即可，如下图所示，然后点击search。如果NCBI的GenBank数据库有这些序列，那么我们就可以找到我们所需要的序列了。当然，数据库中可能会出现很多相关的序列，这时我们需要自己慢慢查找自己需要的序列信息，如下图所示：接下来我们就浏览这些信息，然后将我们需要的信息复制下来，粘贴到TXT或者Word里。这里我们示例选中的是第20条信息，当然你可以打开所有的你需要的信息。如下图所示，我们可以得到基因的全部信息，包括来源、出自那片文献、核酸序列等等。这样，我们的序列查找就完成了。当然并不是所有物种的基因都可以在这里找到，在查不到的情况下，就需要我们自己通过PCR的方法将我们所需要的基因扩增出来，然后测序获得序列信息。第二部分序列比对目前有一些分子生物学软件可以用于序列比对分析，像DNASTAR、ClustalW、MEGA等等，这里我们以MEGA5.0为例进行讲解。首先，将目标序列和其它需要与其比对的序列放入一个文本文档中，以大肠杆菌的16SrDNA为例，格式如下图所示：打开MEGA5.0软件，点击Alignment的下拉菜单，选取Alignment的下拉菜单，选取Edit/BuildAlignment，出现一个AlignmentEditor的对话框，然后选择Creatanewalignment，点击OK。出现下面的对话框，选择DNA软件就会出现下图的界面，单击Edit，选择下拉菜单中的InsertSequenceFromFile然后我们就把大肠杆菌的16SrDNA的序列及其他细菌的16SrDNA序列上传，出现下图的对话框，点击Alignment，选择下拉对话框的AlignbyClustalW，对这个序列进行比对。这是对五条序列进行比对的结果，每种碱基软件会默认标记一种颜色，下图显示是这五种细菌16SrDNA的保守区。从这个图上我们可以看出，在这段区域内碱基序列很保守。下面这段区域变异相对则比较大。到这里序列比对工作基本就完成了。第三部分引物设计首先介绍一下关于LAMP设计的理论概念，基础法的LAMP方法也就是4条引物的情况，从F3到B3一般有300bp这样的一个靶序列人为的分成六个区域，命名为F3、F2、F1、B1、B2、B3，那它对应的互补序列我们就命名为F3c、F2c、F1c、B1c、B2c、B3c，针对这六个区域实际上我们是设计了四条引物，也就是内引物FIP和BIP，外引物F3和B3。F3和B3的作用其实就相当于PCR的上下游引物，它除了不断提供模板这样一个作用以外，它还可以在LAMP反应之中起到置换FIP和BIP延伸而成的新链的作用。最关键的内引物实际上是由两部份组成的，FIP是3’端是F2序列，BIP的是B2序列，比较特殊的是在它们的5’端人为的加上了F1c和B1c这样一个序列。LAMP引物设计的关键因素有：Tm值，引物末端的安定性，GC含量，引物间的距离，二级结构。首先，介绍Tm值，Tm值的定义是引物与模板完全结合的双螺旋结构降解一半时的温度，通常GC含量比较高的引物要求的Tm值也较高；反应溶液里核苷酸的浓度越高，引物与模板越容易结合，Tm值也越大；溶液中阳离子浓度越高，引物与模板的双链结构越稳定，Tm值也就越高。LAMP中六条引物每条引物的Tm值要求，不管是GC含量高还是AT含量高，引物F1c和B1c比其余几条引物的Tm值要高上5oC左右，这是为了在反应中能使F1c和B1c更加容易弯转，可以形成双茎环结构，具体参数如下图所示：第二点是引物末端的安定性，首先介绍一个概念，⊿G也就是吉普斯自由能变。我们指的⊿G前提是模板和引物结合，把这个作为一个化学反应的话，化学反应等号的左边是模板+引物，右边是引物结合到模板上了。这样的话，如果⊿G为负值的话，则该反应是能自由进行的，也就是我们的引物可以很轻松的结合在模板上。每条引物最末端的六个碱基我们计算出来的⊿G值要小于等于-4Kcal/mol，这个值是一个实验数据，⊿G值越小，核苷酸越容易与模板退火结合。在这里遵循这样一个原则，即是F3/B3，F2/B2，LF/LB的3’末端⊿G值要小于等于-4Kcal/mol，F1c和B1c的5’端的⊿G值要小于等于-4Kcal/mol。第三点是关于GC含量，一般我们对引物的GC含量设定范围在：40-60%之间。针对富含AT的序列，引物的GC含量一般会调整到40-50%，正常的情况下是50-60%，如果是富含GC的话则在50-60%之间。第四点时引物之间的距离，从F25’端到B25’端在120-180bp之间，从F2的5’端到F1c的3’端也就是茎环这一段在40-60bp之间，从F2的5’端到F3的3’端在0-20bp之间。具体如下图所示：第五点是关于二级结构，特别要注意引物自身不能形成二级结构，因为二级结构不仅会影响反应效率同时也会导致一些非特异扩增。其中FIP和BIP引物可用其他引物软件再次进行分析确认。一定要确保引物的3’末端没有错配，在PrimerExplorer是专门设置了dimmercheak参数。简单模式接下来具体介绍LAMP技术的引物设计，在线引物设计软件PrimerExplorer有两个版本，一个V3，一个V4。V3是较老的版本，V4版本更加智能化，所以下面所演示的引物设计实例都是使用的V4的版本。首先介绍下简单模式下的引物设计。打开，进入PrimerExplorer引物设计软件的界面，点击PrimerExplorerV4，上传靶序列。注意，这个软件运行需要安装一个Java软件，可以在这个网站上下载，安装，软件才能正常运行。点击PrimerExplorerV4，上传靶序列，这里靶序列的长度应该在300bp~2000bp之间，格式可以为text、fasta、GenBank等。常规情况下，DesignOption选择Default。，设置好之后，点击Generate按钮，通常情况下会出现0~5组引物。然后点击Display按钮，引物会在新的网页中出现，如下图所示：在每组引物前的对话框中打钩，点击Confirm按钮，引物的详细信息则会出现在新的页面中。到这里引物设计的工作就完成了，接下来就是如何选择引物了。这里主要是依据第三部分开始的时候介绍的引物末端的吉布斯自由能变来选择。在这里遵循F3/B3，F2/B2，LF/LB的3’末端以及F1c和B1c的5’端的⊿G值要小于等于-4Kcal/mol原则，来选择引物。以上面的三组引物为例进行分析。从这个表中可以看到，第二组引物F1c的5’末端的⊿G值大于-4Kcal/mol，所以这对引物应该舍弃，第一组和第三组引物可以用实验的方法进行筛选，选出最佳引物。专业模式如果在简单模式下无法得到引物或者得不到合适的引物，这时我们就可以使用专业模式进行引物设计。使用专业模式设计引物时，通常会出现很多条引物，因此需要对参数进行设定。在下图的页面上点击DetailSettings，出显现如下图的界面。然后，点击Generate按钮，就会出来很多引物，这时需要通过改变参数缩小引物组数，接下来具体讲解缩小引物组的原则。(1)如果靶基因的GC含量(45~60%)在正常的范围的情况下，可以把GC含量由默认的40~65%，调节到50~60%；缩小F2~B2之间的上限距离。(2)如果靶基因富含GC(超过60%)的情况下，可以把GC含量由默认的40~70%缩小到50~60%；Tm值的设定，F1c/B1c由默认的64~68oC缩小到64~66oC，F3/B3，F2/B2，由默认的59~63oC缩小到59~61oC。(3)如果靶基因富含AT(GC含量小于45%)，可以把GC含量由默认的30~65%缩小到40~50%；Tm值的设定，F1c/B1c由默认的60~63oC缩小到59~61oC，F3/B3，F2/B2，由默认的55~58oC缩小到54~66oC。这里有一点需要注意，大家在缩小引物组的过程中，要小幅度的对参数进行调节，否则可能会出现没有引物出现的情况。如果我们将靶序列导入，没有引物产生，那么这时就需要放宽参数设定的范围。通用型引物和特异性引物的设计不管是通用型引物还是特异性引物的设计都需要对靶基因进行多序列比对，然后对序列进行手工改造，相同的碱基用“*”表示，不同的碱基用“-”表示，缺失的碱基用“.”表示。序列比对用ClustalW、DNAMAN等软件。以ClustalW为例，首先打开网页，在OutputFormat中选择CLUSTAL；在PairwiseAlignment中选择SLOW/ACCURATE；然后选择DNA，按照下图的格式上传或者直接粘贴到红色箭头指向的对话框当中。比对结果如下图所示(只显示了部分序列)：然后我们需要对得到的比对结果进行手工改造，相同的碱基用“*”表示，不同的碱基用“-”表示，缺失的碱基用“.”表示，改造后的结果如下(只显示了部分序列)：到这里多序列比对和手工改造就基本完成了。接下来将改后的结果上传到PrimerExplorerV4进行通用型/特异性引物设计。如果设计通用型引物就在DesignOption中选择Common；如果设计特异性引物就选择Specific。接下来的操作参照之前介绍过的简单模式以及专业模式的操作，就不做过多介绍了。通用型引物设计特异性引物设计