肿瘤迁移和侵袭试验

肿瘤迁移和侵袭试验——Millicell小室测定法【实验材料】1、肿瘤细胞及其所需培养液；2、Transwell小室（Millipore公司，直径12mm，孔径8μm）；3、人工基质胶（ECM，Sigma公司）；4、24孔细胞培养板；5、无水乙醇、苏木精、伊红染液，棉签；6、载玻片、手术刀片。【实验步骤】1、接种细胞前一天，将ECM胶与预冷的无血清和抗生素（双无）1640按1：7的比例以总量32μl铺在transwell小室的上室面，注意不能有气泡产生；再将小室置于24孔细胞培养板内，超净台内紫外线照射过夜。（做肿瘤迁移实验则不需要此步）2、接种细胞：用不含血清的培养液制备单细胞悬液，将细胞密度调整为2.5×105个/ml，取400μl加入上室中；在下室即24孔板内加入600μl含20%FBS的1640培养液。3、细胞培养：将24孔板置于37℃、5%CO2细胞培养箱内，培养24小时。4、固定细胞：待培养时间结束后，吸尽上室内液体，小心取出上室，用湿棉签檫去膜上面未穿过膜的细胞，自然风干后以无水乙醇置于细胞培养箱内固定20min。5、细胞染色：固定后的细胞先以苏木精染色20min，清水清洗一遍；再用伊红染色20min后清水清洗一遍。6、细胞计数：染色完毕后将小室自然风干，用手术刀片沿压痕将小室膜轻轻切下，置于载玻片上在显微镜下观察、计数。【注意事项】1、由于ECM在室温或温度更高的情况下极易凝固成胶状，且此过程为不可逆的，因此建议在配制人工基底胶时可在冰上操作；2、ECM与双无1640的比例可根据试验情况在1：5到1：10之间调节；3、接种细胞之前一定要细胞计数，细胞密度最好不要超过5×105个/ml；4、下室内的培养液亦可换成小鼠成纤维细胞系NIH3T3条件培养基，制备方法：用含10%FBS的1640培养液在37℃、5%CO2条件下培养，在细胞长势良好的情况下换成双无培养液继续培养24小时，然后收集培养上清液，冰冻保存备用。5、细胞培养的时间依肿瘤细胞类别有所不同。6、细胞固定及染色时应注意每次都要将小室风干，必要时可将小室倒置。7、Harris苏木精染液配制方法：苏木精1.0g硫酸铝钾15g无水乙醇10ml蒸馏水200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精，再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖住瓶口。使用之前用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。8、伊红染液配制方法：伊红Y0.5~1.0g蒸馏水100ml先将伊红Y加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴。附：正常胃癌SGC7901细胞株处理组March20,2009