蛋白质工程及其应用示例

1蛋白质工程及其应用示例摘要：在论述蛋白质工程的基本概念和由来的基础之上,介绍了蛋白质工程的主要内容，并着重阐述了蛋白质工程在工业用酶、食品行业和生物制药三个方面中的应用和前景。关键词：蛋白质工程；简介；发展与应用；1.蛋白质工程的概念和由来蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础的学科，其主要通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。蛋白质工程最早始于1975年美国C.A.Hutehison使用了J.Lederberg1960年推荐的寡脱氧核糖核普酸作为体外诱变剂，经他重新确定此诱变剂的顺序，成功地实现了定位突变试验，培育出了具有各类生物学特性的突变株[1]。而蛋白质工程的命名是1981年由美国的K.Ulemer确定的[2]。继后，许多大学及著名的实验室以及经营生物工程高技术产业的公司大量投资竞相研究与开发。2.蛋白质工程的基本途径从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸（基因）3.蛋白质工程的基本原理基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的基因更换宿主得以异体表达，从而创造生物新类型，但这只能合成自然界固有的蛋白质。蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新的蛋白质分子。4.蛋白质工程的研究内容4.1蛋白质结构分析---基础2蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有的生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质(几毫克~几十毫克)，制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。对子哪些很微量的蛋白质来说，是比较困难的。另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的。肤链结构，这种方法绕过了结晶、X一射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发具有高度专一性的药用蛋白质。4.2蛋白质结构、功能的设计和预测---基础的应用与验证根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肤链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在的两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。目前，正加紧这方面的工作。虽然尚在起步阶段，但在可预见的将来，建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。4.3蛋白质的创造和改造---最终目标蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。物理、化学法:对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质链官能团，分割肤链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法:使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖昔酶、酚酶、酸酶等去除或连接不同化学基团，3利用转酞胺酶使蛋白质发生胶连等等。以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用.缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用。采用基因重组技术或人工合成DNA，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肚键连接而成的肤构成的。氨基酸序列就是蛋白质的一级结构，它决定着蛋白质的空间结构和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的，改变DNA序列就可以改变蛋白质的氨基酸序列，实现蛋白质的可调控生物合成。在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标DNA明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究。4.3.1定位突变蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。通常是改变某个位置的氨基酸，研究蛋白质结构、稳定性和催化特性。噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后，通过复制以双链形式存在。将待研究的基因插入载体M13，制得单链模板，人工合成一段寡核昔酸(其中含一个或几个非配对碱基)作为引物，合成相应的互补链，用连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子的胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。4.3.2盒式突变1985年wels提出的一种基因修饰技术—盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因[3]。4.3.3PCR技术DNA聚合酶链式反应是应用最广泛的基因扩增技术。以研究基因为模板，用人工合成的寡核昔酸(含有一个或几个非互补的碱基)为引物，直接进行基因扩4增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效[4]。4.3.4高突变率技术从大量的野生型背景中筛选出突变型是一项耗时、费力的工作。有两种新的突变方法具有较高的突变率，(1)硫代负链法:核昔酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物(a-(S)-dcTP)对某些内切酶有耐性，在有引物和(a-(S)-dcTP)存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核昔酸外切酶l从3`~5`扩大缺口并超过负链上错配的核昔酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因；(2)UMP正链法:大肠肝菌突变株RZ1032中缺少脉嗜咤糖昔酸和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脉嗜咤(U)替代胸腺嗜咤(T)掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠肝菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制[3]。4.3.5蛋白质融合将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起。经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性。现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等，就是采用的这种方法。5.蛋白质工程的应用示例5.1在工业用酶中的应用5.1.1脂肪酶脂肪酶能催化酯的水解和合成，广泛用于洗涤剂的生产，油脂工业，有机合成，皮革及造纸工业。Beer等人[5]根据酶的X-射线结构建立一模型，并通过定点突变搞清楚了Rhizopusoryzea脂肪酶的催化机制。Okkels等人[6]通过定点突变使CandidaAntarcticaA脂肪酶的比活力提高了4倍。Yamaguchi等人[7]将Cys二硫键引入Humicolalanuginsa脂肪酶中，突变体的热稳定性提高了12℃，酶的最适温度提高了10℃。Patka等人[8]发现CandidaAntarcticaB脂肪酶的M72L突变体抗过氧辛酸氧化作用能力比野生型强。Kampen等人[9]研究了Staphylococcus5hyicus脂肪酶的突变体对底物专一性的影响，发现把356位的Ser用Val来替换，其磷脂酶活性降低了12倍。Egmond等人[10]研究了Fusariumsolanipisi角质酶对阴离子的亲和性。发现过N172K突变，酶表面带有更多的正电荷，同野生型角质酶相比，突变体稳定性更差。在17和196位引入负电荷残基，则酶对阴离子表面剂活性剂十二烷基磺酸锂的稳定性提高。Pseudomonasglumae脂肪酶的154和150位的氨基酸残基用Pro替代，在P1位引入Arg残基，酶的抗蛋白稳定性得到了提高。5.1.2纤维素酶纤维素酶现在已广泛地应用于医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔。大多数工业用的纤维素酶都是葡萄糖苷内切酶，含有一个催化区和一个纤维素连接区。没有纤维素连接区则酶对于纤维素的活性很低。现在研究的重点是了解酶的吸附和活性之间的关系。有人对纤维素酶和蛋白酶进行了对照研究，发现纤维素酶的活性与吸附的强弱关系更大[11]。Koivula等人[12]对Trichodermareesei的纤维二糖水解酶催化区域169位的氨基酸残基Try进行了研究，发现其能协助葡萄糖环转换成更容易反应的构形。Hakamada等人[13]用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的Glu137、Asn179和Asp194突变为Lys，其热稳定性得到了提高。Zhang等人[14]专门研究了T.fusca纤维素酶Ce16A表面残基对底物专一性的影响，发觉突变体R237A对羧甲基纤维素的活力提高了。后来他[15]又研究了靠近活性位点残基对催化活性、底物专一性、配基连接亲和性的影响，4个残基（His159、Arg237、Lys259、Glu263）的7个突变体对羧甲基纤维素的活性都有所提高，其中K259H突变体的活性提高的最为显著。5.1.3淀粉酶淀粉酶的使用范围极广，种类繁多，根据不同的需要可以选择不同种类的酶。α-淀粉酶主要用来生产麦芽糖糊精，葡萄糖淀粉酶催化糊精可得到葡萄糖，用β-淀粉酶可以得到麦芽糖，用葡萄糖异构酶可以将葡萄糖转化为果糖。而一般的淀粉酶催化都是在高温条件下进行的。应用蛋白质工程可提高酶的热稳定性。有人得到B.Licheniformmisα-淀粉酶的双突变体A209V/H133T，酶在90℃的6半衰期延长了9倍。Mitchinson等人用定点突变和高通量筛选的方法得到了一个突变体，其最适pH值提高了0.5～1.0。Gloria等人[16]用Phe或Tyr来替换B.stearothermophilusα-淀粉酶289位的Ala，其具有了催化醇化反应的能力。Sierks等人[17]报道了通过改变葡萄糖淀粉酶活性位点的三个氨基酸残基，其作用于1，4-糖苷键相对于1，6-糖苷键的Kcat/Km比值提高了300倍。5.2在食品工业中的应用5.2.1葡萄糖异构酶的蛋白质工程1992年，Mrabet等人构建了密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶的突变酶K253R，其酶活是野生型的120％，在60.lmol／L葡萄糖底物存在下。它的热失活半衰期比野生型酶提高了5倍[18]。TJibeurgh等人构建的密苏里游动放线菌葡萄糖异杓酶的突变酶E185Q明显改变了酶的最适PH值，而且，与野生酶在Mn2+作用时的活性相比。E185Q要高出两倍[19]。另外，美国Amgen公司曾对大脑杆菌葡萄糖异构酶进行了盒式突变，筛选到两个活性大于野生型的突变酶[20]。葡萄糖异构酶的蛋白质工程是国家“863”计划资助项目，中国科学技术大学生命科学学院在这方面做了大量的研究工作，构建了多种性能改善的突变酶[21-25]，如朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Glyl38)为目标氨基酸后，用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行体外定点诱变