叶绿素荧光研究技术-113页PPT文档

叶绿素荧光分析技术在植物生理生态研究中的应用KautskyandHirsh（1931）发现，将暗适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光（Kautsky效应）。荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。叶绿素荧光现象的发现上世纪80年代，Ögren（1985）和Schreiber（1986）相继创制出便携的调制式荧光仪，并实现了商品化。叶绿素荧光动力学研究得到广泛应用的原因1、叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程的丰富信息●光能的吸收与转换●能量的传递与分配●反应中心的状态●过剩光能及其耗散●光合作用光抑制与光破坏……等等2、可以对光合器官进行“无损伤探查”，获得“原位”的（insitu）信息。3、操作步骤简单快捷。由于以上原因叶绿素荧光动力学技术在：●光合作用生理生态●逆境生理等研究领域得到了较快的普及和广泛的应用直观的叶绿素荧光现象叶绿素溶液在投射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。荧光现象的本质是什么？为什么活体植物的叶片看不到荧光现象？叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其能量传递到光系统2或光系统1。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光.透射光下反射光下当一个叶绿素分子a的电子从激发态回到到基态的去激过程中，一小部分激发能（3-9%）以红色的荧光形式耗散。在生理温度下，叶绿素荧光的波长峰值大约为685nm的红光，并且一致延伸到800nm的远红光处荧光是研究光能分配的探针激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢通过调节PSII反应中心的开放的程度干涉荧光的发射，根据不同情况下荧光的变化来分析光合机构运行情况。ΦF=kfkf+kp+kdФF:叶绿素荧光产量；kf：叶绿素荧光的速率常数；kp：光化学反应的速率常数；kd：热耗散的速率常数荧光发射与原初光化学活动、热耗散过程是互相竞争的一种关系。因此，荧光产量的变化反映了光化学效率和热耗散能力的变化。如何测定叶绿素荧光？现有两类荧光仪可以用来测定叶绿素荧光。1.续激发式荧光仪（如PEA)，必须将测定叶片在避光下测定，在照光条件下，仪器无法区分叶绿素荧光和自然光中与荧光波长相同的红光和远红光。但是这类荧光仪有很高的分辨率，每秒钟能够测定10万次荧光变化，因此是研究光合机构中电子传递瞬间变化的有力工具。2.脉冲调制式荧光仪（如FMS-2)，可以避免上述问题。在测定时，仪器提供一种脉冲调制式光，能诱导出的脉冲式的荧光。当有其它光线同时存在时，会产生以下三种光信号：1.自然光中具有荧光波长的红光信号2.自然光诱导的非脉冲荧光信号3.脉冲调制光诱导的脉冲荧光信号脉冲调整式叶绿素荧光仪原理图1：调制测量光；2：作用光；3：饱和脉冲光；4：远红光；5：检测器及放大器；6：短波通过滤光片；7：长波通过滤光片；8：样品（5）（6）7）8高选择性监测器可以排除前两种信号而只保留脉冲过程中所产生的荧光信号。用脉冲调制式方法，可以在全光照情况下测量叶绿素荧光信号，而不被其它光所干扰。当对暗适应叶片照光时，叶绿素荧光迅速上升，随后有一系列的慢的波动，逐渐下降到稳态。这称为“KautskyEffect”，是Kautsky等在1931年首先报道的。荧光产量的变化反映了光化学效率和热耗散能力的变化。最大荧光荧光波动荧光稳态荧光快速上升过程将时间标尺放大后的荧光动力学曲线对（KautskyEffect）的解释：连续光下荧光产量瞬态上升，这是因为照光后某些碳同化酶需要光活化，因此碳同化途径产生延迟。这使得照光初期相当多的QA处于还原状态，从而导致了荧光产量的瞬态上升。这之后，由于光化学过程和热耗散过程的发生，荧光产量产生淬灭到一个稳态数值（Ft）。暗反应光活化过程XPheoQFdPQNADPCytfO2PCP700光量子H2OZP680光量子光合电子传递链Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm；qP=(F’m-Ft)/(F’m-F’o)；ΦPSII=(F’m-Ft)/F’m；NPQ=(Fm-F’m)/F’m；qNP=(Fm-Fm’)/(Fm-Fo’)t(Fs)主要荧光参数及其意义Fo：初始荧光产量（Originalfluorescenceyield）也称基础荧光，是PSⅡ反应中心（经过充分暗适应以后）处于完全开放状态时的初始荧光产量。Fm：最大荧光产量（Maximalfluoreseenceyield），是PSⅡ反应中心完全关闭时的荧光产量。通常叶片经暗适应20min后测得。Fv=Fm-Fo：可变荧光，反映PSⅡ的电子传递最大潜力。经暗适应后测得。Fv/Fm：暗适应下PSⅡ反应中心完全开放时的最大光化学效率，反映PSⅡ反应中心最大光能转换效率。Fv/Fo：代表PSⅡ潜在光化学活性，与有活性的反应中心的数量成正比关系。Fo’：光适应下初始荧光。Fm’：光适应下最大荧光。Fv’=Fm’-Fo’：光适应下可变荧光。Fv’/Fm’：光适应下PSⅡ最大光化学效率，它反映有热耗散存在时PSⅡ反应中心完全开放时的光化学效率，也称为最大天线转换效率。Ft(或Fs):稳态荧光产量steady-statefluorescenceyield。φPSⅡ=(Fm’-Fs)/Fm’：PSⅡ实际光化学效率，它反映在照光下PSⅡ反应中心部分关闭的情况下的实际光化学效率。qP=(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’)：photochemicalquenching光化学猝灭系数，它反映了PSⅡ反应中心的开放程度。1-qP用来表示PSⅡ反应中心的关闭程度。qNP=(Fm-Fm’)/(Fm-Fo’)：非光化学猝灭系数NPQ=(Fm-F’m)/F’m＝Fm/Fm’-1：非光化学猝灭non-photochemicalquenchingETR=φPSⅡ×absorbedPFD×0.5：PSII电子传递速率RelationshipbetweenPSIIandCO2inmaizeleavesgrowninthefieldatdifferentdates.荧光参数是研究植物光化学效率、光抑制与光破坏防御的有效的工具该技术被广泛的使用在植物生态、植物抗逆性、筛选高光效或抗逆品种、转基因植物的功能分析、光抑制和光破坏的防御机制等方面的研究。光抑制概念:强光造成光合功能下降的过程称为光抑制特征：光合效率下降；Fv/Fm及AQY下降过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认为发生了光抑制就意味着光合机构遭到破坏。甚至把光抑制、光破坏、光漂白、光氧化等概念通用。光抑制:photoihibition光氧化:photooxidation光钝化:photoinactivation光破坏:photodamage光破坏:solarigation光漂白:photobleaching光抑制的基本特征AQY及Fv/Fm下降.说明叶片吸收的光能不能有效地转化为化学能。光抑制的机理光合机构的破坏。PSII是光抑制损伤的主要场所，破坏也可能发生在反应中心也可能发生在与次级电子受体结合的蛋白上。发生光破坏后的结果：电子传递受阻，光合效率下降。产生光破坏的原因：过剩光能产生的高能电子无法利用，产生如chl*,单线态氧、超氧阴离子等氧化性很强的分子破坏光合机构。光破坏的概念当过剩的光能不能及时有效地排散时，对光合机构造成不可逆的伤害，如对光合色素造成光漂白、光合作用中心D1蛋白的降解及光合机构的光氧化等。3P680+O2P680+1O2氧化性极强的1O2首先攻击反应中心色素P680，使PSⅡ反应中心失去电荷分离能力，最终引起D1蛋白降解.PSⅡ受体侧电子传递受阻时易产生此种破坏。Fd－+O2Fd+O2·－O2。－启动类囊体膜的脂质过氧化，破坏光合色素、类囊体系统以及膜结合酶使电子传递效率下降，严重时使电子传递系统失活。P680++β-CarP680+β-Car+PSⅡ供体侧H2O的光解受阻时易产生此种破坏。P680+还能氧化D1蛋白肽链中酪氨酸残基和叶绿素等色素。激发态叶绿素的4种去激发途径一切影响CO2同化的外接界因素如低温、高温、水分亏缺、矿质元素亏缺等都会减少对光能的利用，、导致过剩光能增加，进而加重光破坏。激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光光破坏防御机制CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢植物防御光破坏的措施1减少对光能的吸收●增加叶片的绒毛、蜡质●减少叶片与主茎的夹角2增强代谢能力●碳同化●光呼吸与活性氧清除系统●氮代谢●Mehler反应与活性氧清除系统3.增加热耗散●依赖叶黄素循环的热耗散●作用中心可逆失活●状态转换●第一道防线：天线热耗散（又称“高能态耗散”）此类热耗散依赖于：（1）类囊体膜内外的pH梯度（非环式电子传递、假环式电子传递和环式电子传递均可加大pH梯度）（2）叶黄素循环光合机构处理过剩激发能的方式依赖于叶黄素循环的热耗散叶黄素循环的运转被跨膜ΔpH促进，此外叶黄素循环库在强光下明显增大。叶黄素循环耗散过剩光能的机理：玉米黄质的直接作用（猝灭三线态叶绿素）；LHCII色素蛋白复合物与叶黄素各自形成聚集态并互相靠近，有利于过剩光能的热耗散。OOOHHOH2O2H(NADPH)+O22H(ASCORBATE)H2OHOOOHH2O2H(ASCORBATE)O22H(NADPH)+H2OOHHOVIOLAXANTHINANTHERAXANTHINZEAXANTHIN紫黄质花药黄质玉米黄质叶黄素循环中三种色素的相互转变ZE：玉米黄质环氧化酶ZE的作用VDE的作用VDE：紫黄质脱环氧化酶天线热耗散的最大特点是在过剩光能尚未引起PSII反应中心电荷分离之前，就在天线中将其耗散，这种对过剩激发能处理的方式一是安全可靠二是反应快速●第二道防线：反应中心耗散主要是通过PSII反应中心的可逆（或不可逆）失活，使一部分PSII反应中心由原来的光能转化中心变为过剩光能耗散中心，但是，这种耗散方式实际上已经使一部分PSII复合体受到暂时的或永久性的损伤。是光抑制的狭义的概念。PSII反应中心可逆失活的特点●PSII的失活可能与天线的脱离有关。●正常的PSII反应中心位于基粒类囊体膜，电子传递功能正常；●失活的PSII反应中心位于间质片层膜，不能还原QB，失活反应中心的Fo增高，Fm降低。●失活的反应中心可以修复，涉及D1蛋白的磷酸化。●失活反应中心可形成围绕PSII的循环电子流（P680→Pheo→Cyb559→P680）,电子进行无效循环。第三条防线:状态转换光合机构通过可逆磷酸化,调节PSII捕光色素复合体(LHCII)的捕光量,从而实现激发能在两个光系统间均衡分配的过程。能量满溢（PSII向基粒边缘的PSI靠近）强光下，PSII吸收过多激发能（状态II）PQ处于过度还原态蛋白磷酸激酶被激活LHCII磷酸化LHCII与PSII反应中心脱离，向PSI靠近PSII捕光截面变小，PSI捕光截面变大用荧光动力学曲线区分过剩光能耗散的不同方式可将非光化学猝灭qNP区分为三部分：qNP＝qE+qT+qIqE－高能态荧光猝灭qT－与状态转换有关的荧光猝灭qI－与光抑制有关的荧光猝灭½暗驰豫时间：qE1min;qT~8min;qI40min●第四道防线：活性氧清除通过以上两道防线仍未被耗散掉的激发能，可能在PSII中转移给O2而形成1O2，或以激发态电子的形式在PSI受体端交给O2而形成氧自由基O2-这时便需要通过酶促的或非酶促的途径将活性氧加以清除。叶绿体中活性氧清除酶系以上四道防线可以对过剩激发能进行层层阻截，以减轻其危害。但是，当强光与多种逆境同时存在、这四条途径未能奏效的情况下，将不可避免地产生大量活性氧，造成光破坏。最常见的结果D1蛋白的破坏，更加严重的是叶绿素和类胡萝卜素的降解，使叶片发生“光漂白”。由此也便不难理解，为什么在黑暗中逆境对植物的危害较小，而在光下危害较重，而且光照愈强，逆境危害愈重；此外，处于衰老阶段或长期在弱光下生长的作物对强光十分敏感。这正是植物体内过剩激发能的生成与光合器对同化力的利用和对过剩