凋亡自噬PPT

自噬研究的创新分析方法邓中帆，[e-mail]•自噬与疾病•自噬分析的方法与最新工具−自噬信号通路研究与抑制剂的应用−Biosensors−自噬小体的富集及流式定量分析CellBasedAssays|15July2011什么是自噬?•一种真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，涉及细胞自身蛋白或细胞器通过形成自噬小泡而降解。•自噬异常和多种疾病相关，包括癌症，神经退行性疾病和病原物感染。•自噬研究是目前医学领域热点之一，特别是在肿瘤研究方面。•自噬并不导致细胞死亡6自噬已经成为研究热点Presentationtitleinfooter|00Month0000788自噬和多种疾病相关MetabolicDiseasesInflammation,ImmuneDisorders,InfectionNeurodegenerationCancerApoptosisMitophagyUbiquitin-dependentproteindegradationPresentationtitleinfooter|00Month00009自噬信号通路自噬信号通路10LC3蛋白是检验自噬发生的标志物，LC3ILC3-IITOR(TargetofRapamycin)servesasamasterregulatorofautophagy:criticalroleofkinasesintheautophagysignalingpathwayPresentationtitleinfooter|00Month000011Presentationtitleinfooter|00Month000012Anti-FailAntibodyPromise！Anti-UVRAG(Cat.No.AB2960)Anti-ATG5(Cat.No.ABC14)更多自噬及mTOR通路抗体：millipore.com/AntibodyYinandYangApproachLossofFunctionGainofFunction13信号通路的研究方法•Dominantnegativemutant•knock-down•knock-out•小分子抑制剂proteinBiologicalfunctionmRNADNAKnockoutRNAiSignalingnavigationsmallmoleculeinhibitor,activatorblocker,antagonist在蛋白水平/细胞水平甚至活体动物水平精确调控酶/受体的活性与功能包括小分子抑制剂、激活剂、拮抗剂、阻遏剂等转录调控表观遗传学RNAi还是smallmolecule?RNAi•难以在原代细胞或难以转染的细胞上进行•对于mRNA编码的半衰期长的蛋白无能为力•对于具有二级结构或难以关闭的mRNA无法操作•导致蛋白逐步消失，恢复相关表型也很困难•因为蛋白产物是逐渐减少的，所以难以确定剂量-效应之间的关联Inhibitors•具有很好的细胞通透性，对靶细胞没有特别要求•活性直接针对特定的蛋白起效•可逆抑制剂产生抑制效果和恢复原有细胞功能都很快•非常便于进行剂量-效应研究，数据更丰满•剂量非常容易掌控，数据更精确一万多种产品，世界最大的信号转导、凋亡及癌症研究相关试剂供应商，提供全面的生化、免疫学及细胞生物学产品专门为特定信号通路设计的抑制剂套装，包含12-23种单个抑制剂，大大节约研究者在针对各个阶段的靶分子尝试多种抑制剂上所耗用的时间和试剂成本。脂肪生成调节剂套装（目录号121000）——新！！用于使前成脂肪细胞分化形成成熟的脂肪细胞，研究能量储存、代谢Autophagy自噬调节剂套装（目录号189488）——新！！用于自噬过程的研究，是最新的研究热点之一表观遗传调节剂套装（调节乙酰化目录号324893；调节甲基化目录号324894））——新！！New!自噬调节剂套装189488帮助研究自噬过程机理Presentationtitleinfooter|00Month000019InhibitorSelect™抑制剂及调节剂文库20New!96-WellTyrosineKinaseandPhosphataseInhibitorLibraryIVCatNo.53974783proteinkinaseandphosphataseinhibitors;•50uL/well•0.5-100mMNew!StemSelect™LibraryICatNo.569744303modulatorsofcellfate•50uL/well•0.1-100mM21•使用了Calbiochem激酶抑制剂文库1&2(Calbiochem,Cat.#539744and539745)InhibitorSelect™抑制剂文库应用举例自噬特异性抑制剂筛选及调控机理探索Results:Identificationofsmallmoleculeinhibitorsofautophagy22ScreeningofCalbiochemlibraryNo.539744forinhibitionofrapamycininducedautophagy.MCF7CellsweretreatedwithDMSO,Rapamycin(100nM)orRapamycin(100nM)+inhibitor(2uM)for12h.ThedatarepresentstheRLucLC3wt/RLucLC3G120Areporter-activityratioat12haftertheadditionofthecompounds(T0).TheRLucLC3reporterassaywasperformedusingthelivecellsubstrateEnduren.Thenumbersrepresenttheaverageandstandarddeviationoftwoindependentexperiments.Horizontallinesindicatethelevelsofbackground(top)andrapamycin-induced(bottom)autophagy.DataonPDK1/Akt/FltDualPathwayInhibitorandStaurosporinewereomittedfromthechartbecauseoftoxicity.Adrugwasclassifiedastoxicifmorethan20%oflactatedehydrogenasewasreleasedfromthecellsafter30hofexposure(Farkasetal.,Autophagy2009).23•使用了Calbiochem激酶抑制剂文库1&2(Calbiochem,Cat.#539744and539745)InhibitorSelect™抑制剂文库应用举例自噬特异性抑制剂筛选及调控机理探索•筛选到新的自噬特异抑制剂，不影响细胞生长相关的PI3K-Akt通路，帮助自噬研究的新工具•通过了解新抑制剂的通路靶点帮助了解自噬调控的机理自噬过程示踪的优化•自噬示踪：LC3荧光融合蛋白−无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体•很多自噬研究的细胞类型难以转染？•众多方法中，慢病毒导入法最迅速最高效！24LentiBrite慢病毒自噬BioSensor25LentiBrite™vs.antibodycomparisonandinhibitoranalysis:Presentationtitleinfooter|00Month000026LentiBrite实时荧光观测还可以拍成录像TimelapseFluorescenceImaging:U2OScellswereplatedincoverglasschamberslidesandtransducedwithGFP-p62lentiviralparticles.Imageswerecollectedevery20secondsforatotalof32min.Shownhereare3sequentialframes.CellswereleftincompletemediaorincubatedinEBSScontainingalysosomeinhibitortoinduceautophagosomeformationandinhibitlysosomaldegradation.TheGFP-p62displaysadiffusecytosolicdistributioninfedcells(A),andapunctatedistributioninstarvedautophagiccells(B,C).Presentationtitleinfooter|00Month000027Websitelink:HuMSC(top)&U2OS(bottom)cellsweretransducedwithLentiBrite™GFP-LC3Mutantlentiviralparticlesandwereeither(A)leftincompletemediaor(B)incubatedinEBSScontainingalysosomeinhibitorunderstarvationconditions.TheGFP-LC3ControlMutantdisplaysadiffusenuclearandcytosolicdistributioninbothfedandstarvedautophagiccells(i.e.,notranslocationtoapunctatecytoplasmicdistributionascharacteristicofwild-typeLC3).GFP-LC3GFP-LC3NormalConditions(Fed)Autophagy-induced(starvation)GFP-LC3GFP-LC328LentiBrite™GFP-LC3Mutant(Cat.#17-10189)Presentationtitleinfooter|00Month000029自噬常规研究方法•金标准：电镜观察自噬体•免疫荧光观察LC3的转位：弥散点状•Western检测LC3-ILC3-II这些方法都不能实现完全的自噬定量检测创新方法！简便的流式定量分析方法！30NoshiftofLC3-GFPlevelisdetectedbeforeandafterstarvation无特殊处理选择性透膜处理专利选择性透膜剂&抑制剂防止溶酶体降解自噬小体！17-10230&FCCH100171LC3-II富集试剂盒(FlowCytometry)Presentationtitleinfooter|00Month000031自噬相关试剂盒KitsforWBandFlowCytometry•自噬起始时，LC3-I的C端甘氨酸发生修饰形成LC3-II，LC3-II转位至自噬小泡上呈点状分布。•然而有些时候LC3-I和LC3-II的条带不能完全分开而影响分析。Presentationtitleinfooter|00Month000032自噬相关试剂盒KitsforWBandFlowCytometryPresentationtitleinfooter|00Month000033自噬相关试剂盒17-10232LC3-II富集试剂盒(WesternBlot)细胞凋亡通路研究工具与全面检测方案提纲一.什么是凋亡&凋亡的意义二.凋亡的两条主要途径&如何研究凋亡三.凋亡作为研究工具&如何检测凋亡细