总RNA提取操作步骤

总RNA提取操作步骤2.1实验原理Trizol是一种新型的总RNA即用型制备试剂，适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。Trizol试剂是由苯酚和异硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。Trizol的主要成分是酚，主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。但酚虽可有效的变性蛋白质，却不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。0.1%的8-羟基喹啉与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制；异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。2.2应用范围人、动物、植物和细菌、血液总RNA提取都适用，也可以抽提microRNA等小RNA。提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northernblot、RT-PCR、Dotblot、分离mRNA、RNase保护分析、体外翻译、cDNA克隆、基因表达芯片分析、高通量测序等。2.3实验设备天平，漩涡振荡器，低温高速离心机，各种规格移液器，高压灭菌锅，匀浆器，研钵，微量分光光度计等。2.4试剂及耗材耗材：各种规格枪头，去酶离心管等。试剂：TRIzol，氯仿，异丙醇，无水乙醇，0.05～0.1％DEPC－H2O。2.5操作步骤2.5.1组织抽提1）组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时，在液氮中将组织研磨成粉末，趁液氮未挥发将粉末转移到EP管，室温5000rpm离心去上清。每50-100mg组织，加入1mlTrizol。2）若是新鲜标本经匀浆后转移离心管，加入1mlTrizol。2.5.2细胞抽提1）倒掉培养基，PBS洗，直接将1mlTrizol注入培养瓶（5×106），反复抽吸均匀。2）或收集细胞后加入Trizol反复抽吸均匀。3）匀浆后将液体转入无RNA酶的离心管中，室温放置5分钟，在离心管中加入氯仿（200μl氯仿/mlTRIzol），剧烈振荡15s，室温放置5分钟，4℃下12,000rpm离心15分钟。4）将上层水溶相转移至无RNA酶的离心管中，加入异丙醇（500μl异丙醇/mlTRIzol），轻轻颠倒混匀5次，室温放置10分钟，4℃下12,000rpm离心10分钟沉淀RNA。5）吸弃上清，加入无水乙醇（1ml无水乙醇/mlTRIzol），振荡均匀，4℃下7500rpm离心5分钟，弃上清，干燥沉淀。6）用适量DEPC水溶解沉淀。7）使用微量分光光度计对RNA进行定量，行2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。Tip：必要时进行基因组DNA污染去除1）为了去除基因组DNA的污染，抽提得到的RNA用无RNA酶的DNA酶I处理后使用，处理的具体方法如下：取定过量后的RNA20-50μg，配置如下反应体系反应条件：37℃20min，65℃20min。2）加入100μl无水乙醇，-20℃沉淀RNA1hr以上或过夜。3）4℃，12,000rpm离心10min。4）吸去上清，加入75%乙醇洗涤，4℃，7500rpm离心5min。5）去上清，干燥沉淀后用DEPCddH2O溶解后定量。焦碳酸二乙酯（DEPC）：DEPC即diethypyrocarbonate，中文名为焦碳酸二乙酯。分子式为C6H10O5，分子量为162.14。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。DEPC可以抑制植物细胞上的NSCC,是常用的NSCC抑制剂.DEPC毒性：1．DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)是一种高效烷化剂。配置：加0.1%DEPC到去离子水中，混匀过夜，然后高温高压121℃，20min，DEPC即降解成二氧化碳和水无毒。2．DEPC有刺激性，对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。3．DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。DEPC水泡过一次枪头后还能再用吗?是否每次都要重配DEPC水用于配制电泳缓冲液，和溶解RNA。每次处理耗材时都要用新配的。