表观遗传学 第七章 siRNA与miRNA介导的调控

Epigenetics,2008-2009,Semester1,USTC表观遗传学第七章siRNA与miRNA介导的调控Epigenetics,2008-2009,Semester1,USTCTraditionalRNAsTraditionalTraditionalRNAsRNAsEpigenetics,2008-2009,Semester1,USTC非编码RNA非编码非编码RNARNArRibosomalRNA(rRNA)rTransferRNA(tRNA)rSmallnuclearRNA(snRNA)rSmallnucleolarRNA(snoRNA)rInterferenceRNA(RNAi)rShortinterferingRNA(siRNA)rMicroRNA(miRNA)生物秀-专心做生物的研究历程RNAiRNAi的研究历程的研究历程NatureBiotechnology21,1441-1446(2003)生物秀-专心做生物内容纲要内容纲要内容纲要r一、RNA干扰及其机制r二、MicroRNAs在发育中的调控作用r三、RNAi与异染色质r四、miRNA在癌症发生中的作用r五、siRNA的应用生物秀-专心做生物一、RNA干扰及其机制一、一、RNARNA干扰及其机制干扰及其机制r1.RNA干扰：生物体内通过双链RNA分子在mRNA水平上诱导具有特异性序列的基因沉默的过程r2.转录后沉默：Post-transcriptionalgenesilencing,PTGSr3.表观遗传学中的一种重要现象生物秀-专心做生物年，RichJorgensen将由强启动子控制的Chalconesynthasegene转入淡紫色的矮牵牛花-加深紫色r2.Hypopigmentation:许多花出现杂色，甚至紫色消失，变成白色r3.Co-suppressionHypo-pigmentationRNA干扰的发现RNARNA干扰的发现干扰的发现生物秀-专心做生物年，SuGuoandKennethJ.Kemphues，线虫r2.利用反义RNA技术阻断线虫中的par-1基因。在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强。r3.然而，正义RNA和反义RNA都能够有效地抑制基因的表达！r4.沉默的效应能够在被注射的动物及其后代中保持，虽然RNA转录本在胚胎早期就发生降解RNA干扰：线虫RNARNA干扰：线虫干扰：线虫生物秀-专心做生物双链RNA抑制与其序列同源的基因的表达双链双链RNARNA抑制与其序列同源的基因的表达抑制与其序列同源的基因的表达AndrewZ.FireCraigC.MelloAndrewZ.FireAndrewZ.FireCraigC.MelloCraigC.Mello生物秀-专心做生物(幼虫)Adult(成虫)adultbodywallathighmagnification(高放大倍数的成虫体壁)ControldsRNAds-gfpRNAGFP-reporterstrainPD4251GFPGFP--reporterstrainPD4251reporterstrainPD4251生物秀-专心做生物(高放大倍数的成虫体壁)Nohybridizationandstaining+hybridization(endogenousmex-3RNA)+antisense+hybridization+dsmex-3RNA+hybridizationMex-3RNA干扰MexMex--3RNA3RNA干扰干扰生物秀-专心做生物干扰RNARNA干扰干扰r1.“RNAInterference”:注入dsRNA能够有效地、长期的阻断基因的表达r2.给线虫喂食表达GFPdsRNA的细菌，线虫的GFP表达被抑制(a)，但存在RNAi缺陷的则不被抑制(b)r3.之前的正义正义RNARNA抑制基因抑制基因表达的现象，可能是由于体表达的现象，可能是由于体外转录所得外转录所得RNARNA中污染了微中污染了微量双链量双链RNARNA而引起而引起生物秀-专心做生物植物的免疫系统植物的免疫系统植物的免疫系统r1.植物细胞可以通过降解病毒RNA的方式来对抗病毒的入侵，称为转录后沉默(PTGS)r2.外源基因诱导的RNA沉默是植物对抗病毒和转座子的一个防御系统r3.绝大多数的植物病毒具有单链RNA基因组，进入细胞之后从释放其基因组，由病毒编码的RNApolymerase产生正义和反义的RNA，并形成dsRNA，触发RNAi机制从而抵制其自身的序列生物秀-专心做生物干扰的过程RNARNA干扰的过程干扰的过程r1.从双链RNA产生的小干扰RNA可以用不同机制关闭基因的细胞机器r2.为什么外源的dsRNA能够抑制与其序列同源的基因的表达？生物秀-专心做生物介导的基因沉默miRNAmiRNA介导的基因沉默介导的基因沉默rA.Postinitiationmechanisms.miRNA通过阻碍翻译的延伸，或者促使核糖体与mRNA分离来抑制mRNA的翻译rB.Cotranslationalproteindegradation.在多肽链翻译后的同时使其降解生物秀-专心做生物介导的基因沉默(2)miRNAmiRNA介导的基因沉默介导的基因沉默(2)(2)rC.Argonaute与eIF4E竞争结合caprD.Argonaute招募eIF6，从而阻止大的核糖体亚基与小亚基的结合生物秀-专心做生物介导的基因沉默(3)miRNAmiRNA介导的基因沉默介导的基因沉默(3)(3)rE.Argonaute通过脱腺苷化(deadenylation)阻止loopmRNA的形成rF.MicroRNA-mediatedmRNAdecay.miRNA触发脱腺苷化并使得底物mRNAdecapping生物秀-专心做生物干扰的分子机器RNARNA干扰的分子机器干扰的分子机器r1.Dicer:RNaseIII类似的，包含多个功能结构域的核糖核酸酶，将dsRNA切割成小的shortinterferingRNAs(siRNAs)ormicroRNAs(miRNA)，并将这些产物加载到RISC上r2.RISC(RNAinducedsilencingcomplexes)(RNA诱导的沉默复合体):包含多个蛋白质的复合物，将与之连接的siRNA或miRNA定位到其靶点并抑制靶基因的表达生物秀-专心做生物贾第鞭毛虫DicerDicerr序列的结构组成:r1.一个PAZ结构域，与dsRNA的末端结合r2.两个RNaseIII结构r3.其他的功能结构域生物秀-专心做生物有一个OB折叠，与ssRNAs的3’端有较弱的亲和力，允许PAZ与dsRNAs露在外面的两个核苷酸结合r2.Dicer的PAZ结构域能够识别Drosha切割的产物末端生物秀-专心做生物的三级结构：贾第鞭毛虫Dicer的三级结构：贾第鞭毛虫r1.PAZ结构域与两个具有催化活性的RNaseIII结构域分离r2.PAZ结构域与RNaseIII结构域的距离为65angstrom，与25个bp的RNA长度一致r3.Dicer是一个分子尺，负责识别dsRNA并在特异位点切断Epigenetics,2008-2009,Semester1,USTCAGO2AGO2DicerDicerTRBPTRBPRISCRISC生物秀-专心做生物(AGO)：RISC的核心成员Argonaute(AGO)：RISC的核心成员r1.Argonaute(AGO):大的蛋白质家族，为RISCs的核心成员r2.AGO蛋白质一般包含PAZ和PIWI两种功能结构域r3.PAZ与双链siRNA3’-端露出的两个核苷酸结合r4.PIWI负责将双链siRNA切成单链r5.PAZ和PIWI对于SiRNA与底物mRNA之间的相互作用是必须的，并负责底物的断裂或转录抑制r6.不同的AGO具有不同功能，例如人类AGO2负责的RISCs能够割裂底物mRNA，而AGO1和AGO3则不能生物秀-专心做生物介导的mRNA割裂siRNA介导的mRNA割裂生物秀-专心做生物的加载与激活RISCRISC的加载与激活的加载与激活生物秀-专心做生物干扰RNA干扰r1.dsRNA首先需要被Dicer相关的复合物进行处理，然后在Argonaute相关的复合物的引导下发挥功能；r2.Dicer和Argonaute家族的成员在RNA诱导的沉默通路中发挥功能，不同的组成通过不同的机制引起沉默r3.例如，不同的Argonaute相关复合物能够引起不同的沉默过程(mRNA降解vs.翻译抑制)生物秀-专心做生物的加工MicroRNA的加工r1.MicroRNA(miRNA):一种非编码小的RNA(~21–23bp)，通过Dicer剪切其前体RNA(~70-90)所得r2.miRNA以RNA-蛋白质复合物的形式，在动物和植物的细胞中广泛的表达，也称为miRISCsr3.在发育的过程中起着关键性的作用，能够促使与miRNA序列同源的靶基因的mRNA的降解或者翻译