FRAP-protocal

FRAPprotocal分光光度计测：40mmol/L盐酸溶液：取浓盐酸(12mol/L)0.1ml加水至30ml，置于避光处，备用。三氯化铁溶液：称取0.1625g的FeCl3，用蒸馏水定容至50ml，置于避光处，备用。0.3mol/L醋酸钠缓冲溶液：称取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20ml，用水稀释定容至250ml，置于避光处，备用。10mmol/LTPTZ溶液：称取TPTZ样品31．233mg，用40mmol/L的盐酸定容至10ml，置于冰箱中冷藏备用。(2)番茄乙醇提取物总抗氧化能力的测定FRAP法Fe3+吡啶三吖嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。取0.3ml样品，加2.7ml预热至37oC的FRAP工作液，摇匀后放置10min，于593nm测其吸光度值(A值)。样品分别作10倍、20倍、40倍稀释，做三个稀释度(用无水乙醇作为参比)，以无水乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白，每个稀释度做3次平行试验，求平均值。根据反应后A值，在标准曲线上求得相应FeSO4的浓度(μmol/L)，定义为FRAP值。FRAP值越大，抗氧化活性越强。FeSO4标准曲线的绘制：准确称取6．08mg硫酸亚铁溶于适量的水中，加入18mol/L的硫酸0.25ml，再加水稀释至50ml定容，并置入小铁钉。取上述溶液5ml于5ml的水，定容至50ml，即为800μmol/LFeSO4标准溶液。预先用小试管装5ml水，取5mlFeSO4(800μmol/L)标准溶液加入试管中，配制得400μmol/L标准溶液，按此方法依次进行，配制200μmol/L、100μmol/L。50μmol/L、25μmol/L标准溶液，绘制标准曲线(图1)，得回归方程为：Y=0．0023X+0．191，R2=0．9996。[4]BenzieIFF，StrainJ．Theferricreducingabilityofplasma(FRAP)asameasureof“antioxidantpower”：theFRAPassay．AnalyticalBiochemistry，1996，239(3)：70-76．参照Benzieetal.(1996)的方法，原理为Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ，sigma)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。主要步骤如下:取20μl上述样品上清，加入1.8mlTPTZ工作液(由0.3mol/L醋酸盐缓冲液25ml、10mmol/LTPTZ溶液2.5ml、20mmol/LFeC13溶液2.5ml组成)，混匀后37oC反应30min，测定593nm处吸光度，以1.0mmol/LFeSO4为标准，样品抗氧化活性(FRAPvalue)以达到同样吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。标准曲线制作:用一系列不同浓度的FesO4按上述条件处理，测定吸光值，得浓度-吸光值曲线如图2-2示。结果表明，当FesO4在所用体系中浓度为0-0.2μmol/L时与其浓度呈先行关系，且在此范围内的线性回归方程为:y=3.9242x-0.0006，R2=0.9999新配制的900μLFRAP溶液在37℃下保温，与90μL双蒸水、30μL试样混合，以去离子水作为空白对照。混匀后37℃反应10min，593nm测定其吸光度。根据标准曲线，最终结果表示为相当于将样品还原为1mM的FeSO4所需的试样的量。标准曲线的绘制:配制2mM、lmM、0.5mM、0.25mM、0.125mM的FeSO4溶液，在593nm处测定吸光值，制作标准曲线(图2-1).FRAP溶液:2.5mL10mmol/L的TPTZ工作液(用40mmol/L的盐酸溶解)，2.5mL20mmol/L的FeCl3·6H2O和25mLO.3mol/L的醋酸缓冲液(pH3.6)混合均匀即得。酶标仪测定：标准曲线的绘制:吸取2.5mL系列浓度为25,100,150,200,500,1000μmol/L的FeSO4溶液，与2.5mL10mmol/LTPTZ溶液(用40mmol/LHCl配制)和25mL300mmo/L醋酸盐缓冲液(pH3.6)馄合，再吸取该混合液170μL加人96孔酶标板中，放人BenchmarkPlusTM酶标仪(BIORAD公司)内，升温至37℃，于593nm下读取吸光值。以FeS04溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。提取物溶液总抗氧化活性的测定:吸取2.5mL20mmol/LFeC13.6H20溶液，与2.5mL10mmol/LTPTZ溶液(用40mmol/LHCI配制)和25mL醋酸盐缓冲液(300mmol/L,pH3.6)混合，再吸取该混合液150μL加人96孔酶标板中，放人酶标仪内，升温至37`C，于593nm处读取吸光值A反应前.(TPTZ溶液本身有颜色)，之后在孔中加人20μL质量浓度为0.75mg/mL的提取物溶液(石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物用甲醇溶解，水提取物用水溶解),8min后于593nm处读取吸光值A反应后。由A反应后-A反应前的差值在标准曲线上获得中草药提取物相应的FeS04的浓度(μmol/L)，定义为FRAP值。FRAP值越大，表明由抗氧化物质还原的FeS04越多，即抗氧化物质的抗氧化活性越强。采用同样的方法获得0.75mg/mL抗坏血酸和BHT的FRAP值，所有试验重复3次。·0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.00.00.20.40.60.81.01.2吸光度值FeSO4浓度(mmol/L)y=1.03245x+0.00568R2=0.99410.00.20.40.60.81.01.20.00.20.40.60.81.01.2吸光度值FeSO4浓度(mmol/L)y=1.03245x+0.00568R2=0.99413．赵文恩，郭朋辉，白琳，张夏，类胡萝卜素对白血病K562细胞增殖及对PPARγ蛋白表达影响．第7届全国自由基生物学与自由基医学学术会议暨第三届海峡两岸自由基生物学与自由基医学研讨会论文摘要集，2008，p24，北京