农产品分析3-2

第三节氨基酸的测定氨基酸分析氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。全氨基酸和个别氨基酸的分析测定是研究蛋白质、酶的化学组成及性质的重要手段。生物学及农业科学的许多领域都需要分析氨基酸，在评价谷物的蛋白质营养价值时需要测定游离氨基酸及蛋白质中氨基酸的组成。动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为构成蛋白质的氨基酸和游离氨基酸两种。另外，还有微量的由肽键连接的几个氨基酸，以及与糖或脂结合在一起的。在人类和动物营养学上，各种氨基酸含量的高低是很重要的，特别是几个限制性氨基酸。若缺乏这些氨基酸，人与动物不仅不能发育，还会引起某些疾病，而这些氨基酸在贮存和加工过程中极易损失破坏。测定它们的含量已成为衡量谷物、饲料蛋白质的重要标准之一。•成人必需氨基酸共有８种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。如果饮食中经常缺少上述氨基酸，可影响健康。对婴儿来说，组氨酸也是必需氨基酸。必需氨基酸的种类、数量及构成比例，越接近机体合成蛋白质所需的各种氨基酸的量及其组成则机体对氨基酸的利用率越高。氨基酸的测定•氨基酸分析方法包括测定氨基酸总含量及测定全氨基酸中每种氨基酸含量两个方面。测定氨基酸总量的方法与蛋白质分析有密切关系，许多测定蛋白质全氮含量的方法如凯氏定氮法及各种比色法均可用于测定氨基酸的总含量。此外，测定氨基酸总含量的方法还有氨基酸的甲醛滴定法及茚三酮比色法。•有关氨基酸的测定方法很多，近些年来氨基酸分析采用了一系列微量分析及高效率的分离方法。例如，薄层层析、气相色谱、液相色谱、氨基酸自动分析仪等方法。•氨基酸自动分析仪是测定氨基酸的专门仪器,氨基酸自动分析仪的最大优点是氨基酸不用衍生,可直接对其分离,从而避免了由于衍生所造成的测定误差，因其方便、快捷、准确,实现多种氨基酸的同时测定，已广泛应用于各个行业测定氨基酸。原理氨基酸分析仪的中心是离子交换层析柱，当流动相（缓冲溶液）推动氨基酸流经装有阳离子交换树脂的色谱柱时（日立835-50为磺酸型Na+柱），氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同的PH值的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力不同而将氨基酸混合物分开。非极性氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸极性氨基酸极性中性氨基酸：色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸♦其中：属于芳香族氨基酸的是：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸属于亚氨基酸：脯氨酸含硫氨基酸：半胱氨酸、蛋氨酸洗脱的顺序为：酸性氨基酸和极性较大的氨基酸,其次是非极性的和芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）。相对分子质量小的比相对分子质量大的先下来，被洗脱的氨基酸用茚三酮显色，进行定量比色分析。利用经硫化的阳离子交换柱,可分离二十多种氨基酸,将分离得到的氨基酸与水合茚三酮反应生成兰紫色化合物,,在可见光范围(570nm和440nm)测定吸光度,从而完成检测和定量测定。与氨基酸的标准溶液相比较,从而确定各种氨基酸的含量，根据与标样物比较相对保留时间和加入标样使峰增高法进行定性,采用内标和标准曲线法进行定量。内标法:内标法是将一定量的纯物质作为内标物,加入到准确称量的试样中,根据被测物和内标物的质量及在色谱图的峰面积或峰高的变化,就可以看出标准品和样品进样体积的差别。•内标物要满足以下要求：1.试样中不含有该物质；2.与被测组分性质比较接近；3.不与试样发生化学反应；4.出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。•试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS外标法也称为标准曲线法:外标法就是用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度作一条标准曲线,测出样品的峰面积或峰高,在标准曲线上查出其对应的浓度•特点及要求：1.外标法不使用校正因子，准确性较高，2.操作条件变化对结果准确性影响较大。3.对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。测定样品处理除去脂肪等杂质后的待测样品，可直接上柱分析。若测定蛋白质样品的氨基酸组成，必须经酸水解把蛋白质完全变成游离氨基酸后才能上柱分析。蛋白质中的胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸在酸水解条件下不稳定，需采用另外的处理方法，即胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸首先在控制条件下用过甲酸氧化，使它们转变为对酸稳定的氧化物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，然后再用盐酸水解法从蛋白质中分离出来.色氨酸则采用碱水解法从蛋白质中分离出来。样品分析•把经处理后的样品上柱分析，上柱的样品量视自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸0.1nmol左右(水解样品干重约0.3mg)。•根据峰出现的时间来确定氨基酸的种类，从峰的高度和宽度可算出各种氨基酸的精确含量。实验条件•实验仪器:HITACHI835-50型高速氨基酸自动分析仪•色谱条件:色谱柱:2.6mmID×150mm;柱温:53℃;•流速:0.225mL/min。•测定条件：必须在pH5～5.5，100℃下进行反应时间为10～15min，生成的紫色物质在570nm下进行比色测定。其生成的黄色化合物在440nm下进行比色测定。•样品中氨基酸的浓度835-50型号氨基酸分析仪器的氨基酸适宜浓度为1-10nmol/50ml，脯氨酸6nmol／50ml。•缓冲液的pH与Na+浓度溶液的pH值和钠离子浓度对氨基酸的分离有很大关系，配制不当会影响峰的位置，甚至会使个别氨基酸丢失，因此应特别精心配制。•柱温氨基酸的分离与柱温有关835型氨基酸分析仪柱温规定53℃.•树脂的污染污染的树脂也会使分辨率降低。微生物、蛋白质污染（游离氨基酸样品）、金属离子污染、油腻污染等。•除氨在色谱柱前附加一除氨柱，除去缓冲液、试样或流路系统中混入的氨，防止氨在分离过程中被洗脱下来。因此，除氨柱可重复连续使用。•茚三酮的氧化茚三酮很易氧化，氧化后显色效率降低，甚至变质失效。因此，除注意N2气保护外，茚三酮试剂不可过量配制和长期使用。•柱层析的阳离子交换树脂是磺酸型强阳离子交换树脂（苯乙烯-二乙烯基苯）。•定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成紫色化合物。而脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物。•用离子交换柱层析测定的氨基酸图谱如图1-1，2所示出峰的时间顺序：•天冬氨酸（Asp）、苏氨酸**（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）•甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、色氨酸**（Trp）、缬氨酸**(Val)•蛋氨酸**（Met）、异亮氨酸**（Ile）、亮氨酸**（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸**（Phe）•赖氨酸**（Lys）、NH3、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）**为必需氨基酸•氨基酸总量(氨态氮)的测定单指示剂甲醛滴定法•方法原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式可能以下面三种形式存在。试剂1、40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1MNaOH溶液中和。2、0.1％麝香草酚酞乙醇溶液。3、0.100M氢氧化钠标准溶液。操作步骤：称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OOMNaOH溶液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。再用0.1OOMNaOH溶液滴定至淡蓝色。记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算计算：氨基酸态氮(％)=(N·V×0.014×100)/W式中：N：NaOH标准溶液当量浓度。V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)W：样品溶液相当样品重量(克)。0.014：氮的毫克当量。•双指示剂甲醛滴定法•方法原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂。从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近，单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。试剂：1、三种试剂同单指示剂法2、0.1％中性红(50％乙醇溶液)操作步骤：取相同的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中，一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.100NNaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20ml，摇匀，以0.100NNaOH准溶液滴定至淡蓝色。按下述公式计算。计算：氨基酸态氮(％)=[N(V2-V1)×0.014]/W×100式中：V2：用麝香草酚酞为指示剂时标准碱液消耗量(毫升）V1：用中性红作指示剂时碱液的消耗量(m1)。N：标准碱液当量浓度。W：样品的重量(克)。．0.014：氮的毫克当量。注意事项：测定时样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定赖氨酸的测定（染料结合赖氨酸法-DBL法）赖氨酸是各种谷物，食品中重要营养成分之一,是人体需要的八种基本氨基酸中最重要的一种营养成分（赖氨酸是一种必须的氨基酸），所以,也是衡量食品质量及改良谷物品种的主要指标之一。在绝大多数谷物中，赖氨酸是最缺乏的氨基酸，被称为“第一限制氨基酸”。它在谷物贮存、加工过程中，又很不稳定，易于脱去氮基、被氧化或是发生变质而损失破坏，或变成营养上的‘‘无效”，提高谷物及谷物产品中赖氨酸的含量已引起农业育种专家及营养学家的注意，所以，提高籽粒赖氨酸含量已列为谷物新品种选育的主要选育目标之一。国内外应用最广的分析方法有:三硝基苯磺酸法、2-氯-3,5-二硝基吡啶法、离子交换色谱法(氨基酸自动分析仪法)、DBL法。前两种方法共同缺点是操作手续繁长费时，还需要某些特殊的试剂。离子交换色谱法仍然被认为是标准法，但仪器昂贵不能普及。DBL法简便、快速、准确,适用范围广,适用于各种谷物及食品的分析,被定为国标方法。DBL法的原理在较强酸性(pH值2-3)条件下,样品蛋白质中的3种碱性氨基酸,即赖氨酸、组氨酸和精氨酸可与酸性橙12染料(AO-12,一种单磺酸盐)分子结合,生成不溶性络合物，其染料的被结合量相当于赖氨酸、组氨酸和精氨酸的总和；取相同的另一份样品,先用丙酸酐作为掩蔽剂将赖氨酸的ε-氨基掩蔽,然后再与AO-12染料反应,所得染料的结合量只是组氨酸和精氨酸二者之和，根据两次染料结合量（DBC）的差值,即可算出该样品中蛋白质的赖氨酸。OOêêêê赖氨酸的e—NH2+CH3—CH2—C—O—C—CH2—CH3®O丙酸酐êêe—HN—C—CH2—CH3+CH3—CH2—COOH丙酰丙酸•结果计算由测得的透光率T或吸收值A，在标准曲线上查得或由回归线计算得到剩余染料溶液的浓度（mmol/L),样品中的赖氨酸的浓度按下式计算：mol/L)赖氨酸的摩尔质量(g浓度(mmol/L)酸性橙红染料溶液初始比0.2）与20之体积2为（20为加入染料溶液量L）溶液浓度（mmol/的剩余染料各为酰化与不酰化样品式中赖氨酸——；—）（——、：）（146.23.891.111002.14610}/)]11.1(89.3[/)]11.1(89.3{[%3mlVccVmcmcDCBABABADCDC说明及注意事项采用过60目的样品如果剩余染料溶液的浓度超出标准曲线范围时称样量应作适当调整。残余染料浓度的大小对测定结果有影响要调节称样量，加入丙酸酐及未加入丙酸酐的两份样品残余染料浓度应彼此接近（浓度差不大于0.3mmol/L），残余染料的浓度在：1.2～1.8mmol/L的范围内。称样量是保证DBL法准确度的关键，且酰化与否的两份样品的称样量也必须是不等的，酰化样品的称样量应大约为不酰化样品的1.4倍，谷物饲料中，约1.56倍.丙酰化反应和染料结合反应，一般