干细胞的体外培养

干细胞的体外培养一、干细胞的概念干细胞(stemcells,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。干细胞几个主要特征具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，以维持自身数目的恒定。既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂4干细胞的对称分裂和不对称分裂对称分裂（symmetrydivision）不对称分裂（asymmetrydivision）干细胞分化细胞干细胞分化细胞干细胞几个主要特征干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组织的细胞（ES细胞），或可以分化成为本系统各谱系的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。干细胞几个主要特征干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化潜能干细胞几个主要特征干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞。二、干细胞的分类1、按分化潜能大小来分类:全能干细胞（Totipotentstemcell）：能分化成所有组织和器官的干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。多能干细胞（pluripotentstemcell），具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞。专能干细胞（unipotentstemcell），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。2、根据来源来分:来源于胚胎---胚胎干细胞ESC（EmbryonicStemCell）胚胎性生殖细胞EGC（EmbryonicGermCell）来源于成体组织---成体干细胞ASC（Adult-derivedStemCell）胚胎干细胞指从着床前的胚胎内细胞团（桑椹胚）或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。成体干细胞是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。来源于成年组织或器官，一般具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:胎胎干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞成骨干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞三、干细胞研究的历史情况1959年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（embryonicgermcells,EG细胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（embryoniccarcinomacells,EC细胞）是一种干细胞。1968年，Edwards和Bavister在体外获得了第一个人卵子。70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的EC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。1978年，第一个试管婴儿在英国诞生。1981年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠ES细胞，并建立了小鼠ES细胞体外培养条件。将ES细胞注入小鼠，能诱导形成畸胎瘤。1984-1988年，Anderews等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（embryoniccarcinomacells,EC细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。1989年，Pera等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞：JamesA.Thomson在Wisconsin大学领导的研究小组的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取innercellmass细胞，建立细胞株。JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大学领导的另一个研究小组的方法是：从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞(primordialgermcell)，建立细胞株。1999年12月，美国科学家在《美国科学院院刊》报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性。1999年12月，干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该年度世界十大科学进展之首。2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的JamesThomson研究小组分别获得诱导多能性干细胞（inducedpluripotentstemcell，iPS细胞）。至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：小鼠的胚胎干细胞（1981）金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994，1997）、鸡（1996）、恒河猴（1995）、绒猴（1996）。分离得到人的胚胎干细胞（1998），胚胎生殖细胞（1998），目前不断报道成年组织来源的的干细胞。四、胚胎干细胞的体外培养（一）技术原理基本原则：促进ES增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。有饲养层（feederlayer）培养法：以小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）或小鼠胚胎成纤维细胞（MouseEmbryoFirbroblasts,MEF）制备饲养细胞单层，主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备条件培养基。（二）基本过程饲养层细胞制备或条件培养基制备胚胎的制备和培养胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的鉴定冻存与复苏细胞克隆形态碱性磷酸酶检测核型的鉴定分化能力的观察嵌合能力的测定1、饲养层细胞培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）：取孕12.5-14.5d鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。STO细胞：按照一般已建细胞系培养方法。DMEM加10%小牛血清作为培养液。采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存，用时复苏。MEF和STO的优缺点：MEF分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比STO强，STO作饲养细胞时常需在培养基中加入LIF。MEF不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细胞，STO则可长期传代培养。MEF不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。SNL细胞为转染了neor抗性基因和LIF基因的STO细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带有neor抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。胚胎干细胞培养过程中，死亡MEF或STO的染色体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。使用前如用丝裂霉素C处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素C会影响胚胎干细胞的增殖。报道的人源性滋养层细胞：人骨髓来源的间充质干细胞胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞新生儿包皮成纤维细胞成人子宫内膜细胞人胎盘成纤维细胞人胚胎干细胞经体内分化获取的间充质干细胞2、饲养单层制备MEF或STO连成一片，以含10μg/ml丝裂霉素培养液370C作用2-3h（如细胞层较薄，也可缩短至30min-1.5h），或γ射线照射（剂量为30-100Gy）。弃含丝裂霉素培养液，PBS洗5次，γ射线处理者不用清洗。消化细胞，制备悬液种植至用0.1%明胶处理过（0.1%明胶水溶液覆盖培养瓶表面，室温2h以上）的培养瓶，种植细胞数：MEF7.5×104-105个/cm2，STO为5×104个/cm2。培养至细胞连成一片没有间隙（中间可补加处理过的细胞），制备好的饲养单层置培养箱，5天内使用，使用前换成干细胞培养液。观察：好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。MEF和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。3、用于培养胚胎干细胞的条件培养基直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使终浓度为1000U/ml。Baffalo大鼠肝细胞株BRL条件培养基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分化的因子DIF。收集培养72h的培养液，过滤除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干细胞培养液，再添加8-10%胎牛血清。年龄2-3周大鼠心肌细胞条件培养基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集1-6代细胞培养液，过滤除菌，用前6份+3份胚胎干细胞培养液+1份胎牛血清。4、胚胎干细胞的分离和培养（1）培养液配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水要现用现制。高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为（4.5g/L）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。使用前还要添加β-巯基乙醇（0.1mmol/L）或单硫甘油（0.15mmol/L）：保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺点。血清缺点：成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外源性基因功能的测定；可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子；含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞生长。无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴附力不如有血清培养基。（2）胚胎干细胞的分离小鼠：母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培养：培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养胚胎干细胞分离：普通分离法、免疫外科法，弃除滋胚层细胞，获得内细胞团（innercellmass，ICM），并分散为3-4个细胞在一起的细胞团人胚胎干细胞来源a.自终止妊娠（5-9周人工流产）的胎儿中提取生殖母细胞(primordialgermcell)。28Gearhart法29b.取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。用这种方法，每个胚胎可取得15－20个细胞用于培养。Thomson法c.通过体细胞核转移技术（SCNT技术）获取30其它干细胞的分离与纯化干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为CD34+和Thy10+而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。（3）胚胎干细胞培养有饲养层细胞培养：将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，370C、5%CO2、饱和湿度培养2d后出现小集落，并逐步增大，6-10d可消化传代，消化时，消化30s后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为2-3min加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大