核酶PPT课件

核酶Ribozyme（一）对酶及生物催化剂的认识的发展一、概述生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶enzyme极端酶extremozyme抗体酶abzyme生物工程酶其它：模拟酶核酸类:克隆酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme（二）酶的发现1773年，意大利科学家斯帕兰扎尼（L.Spallanzani,1729—1799）设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼中，然后让鹰吞下去。过一段时间他将小笼取出，发现肉块消失了。于是，他推断胃液中一定含有消化肉块的物质。但是什么，他不清楚。1836年，德国科学家施旺（T.Schwann,1810—1882）从胃液中提取出了消化蛋白质的物质。解开胃的消化之谜。1926年，美国科学家萨姆钠（J.B.Sumner,1887—1955）从刀豆种子中提取出脲酶的结晶，并通过化学实验证实脲酶是一种蛋白质。20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。酶定义：酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。20世纪30年代1968年FrancisCrick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上AlanWeiner做会议总结时又重复了20年前FrancisCrick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。（三）核酶的发现1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度Mg2+存在下，与留下的RNA部分(M1RNA)具有与全酶相同的催化活性。1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。T.Cech的工作T.Cech的重要发现开始于1981年。研究目的：细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意义的序列，或“内含子”（intron），如何从RNA分子中剪切下来的。根据过去传统的概念，这一过程必须要有蛋白质酶来完成。T.Cech的工作研究对象：原生动物四膜虫，其含有一种RNA，其组成中除了核糖体RNA外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列（interveningsequenc，IVS）。研究发现：转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。催化反应是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的，称为自我剪接。IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键。相信rRNA前体能靠自己完成剪接过程。在一定条件下rRNA前体可以按一定方式盘绕，进而自己切割自己，以后再把保留rRNA部分的末端连接起来。即它是可以催化自由底物的具有酶活性的RNA。RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应。S.Altman的研究工作t-RNA分子的剪接过程。研究目的：t-RNA分子的剪接过程。研究发现：在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核糖核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中的RNA能够切割tRNA前体的5’端。核糖核酸酶P是一种核糖核蛋白,含有一个单链RNA分子,长度为375个碱基，结合一个相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基)。过去都认为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。(ThomasRobertCech)(SidneyAltman)核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。（四）核酶发现的意义1.它突破了“酶是蛋白质”的传统概念。现代的酶定义：酶由生物体内活细胞产生的、具有催化功能的生物大分子。2.核酸性酶的发现对科学家们普遍感兴趣的生命的起源这一问题有了新的认识，对生物前化学有重要贡献。长期以来，人们认为所有的生命形式在冗长的相互依赖的循环中，信息分子和功能分子是分离的。核酸是信息分子，而蛋白质是功能分子。核酸性酶的发现给人们以启示，即RNA分子不但有复制的功能，含有复制的信息，而且还有催化的功能。因此既是信息分子，又是功能分子。这些新的概念无疑将对生物前化学的研究开辟新的思路。二、核酶核酶（ribozyme）泛指一类具有催化功能的RNA分子。一般是指无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的RNA分子。剪切型核酶剪接型核酶根据催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP（一）核酶（ribozyme）的分类定义：指RNA分子被磷酸二酯酶水解切割后，伴随着形成新的磷酸二酯键，即磷酸二酯键的转移反应或称转酯反应。作用机制：通过既剪又接的方式除去内含子。分类：1.剪接型核酶I类内含子II类内含子这类核酶的作用是只剪不接，催化自身RNA或不同的RNA分子，切下特异的核苷酸序列。分类：2.剪切型核酶自身催化剪切型RNA异体催化剪切型RNA：核糖核酸酶P(RNaseP)•锤头结构(Hammerhead)•发夹结构(Hairpin)•斧头结构(Axehead)•假结样结构(Pseudoknot-like)（二）核酶的结构（三）核酶是一种金属依赖酶。金属离子的作用：特异的结构作用，或参与活性部位的化学过程促进RNA的总体折叠二价金属离子（如Mg2+）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成CCCUCUOP+HOG3’OAoooCCCUCUOPOAoOGCCCUCUOH+P-oGoAoo过渡态CCCUCUOPOAoOGoCCCUCUOPOAoOGMg2+Mg2+o过渡态金属离子催化（四）核酸酶P（RNaseP）RNaseP功能：核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。M1RNA具催化作用：375个碱基蛋白质作为辅助因子：119个氨基酸残基体内：M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。体外：RNaseP底物的二级结构（五）影响核酶活性的因素pH值：pH7.0-7.5时核酶活性最高；二价金属离子：如Mg2+Mn2+；抗生素：大多数为抑制效应；变性剂：温度：在65℃范围内随温度升高而增加，37℃时均有适宜的活性。化学本质是RNA底物：RNA、肽键、α-葡聚糖分支酶反应特异性(专一性）：依据碱基配对催化效率低（六）核酶作用的特点1995年6月，Cuenoud等设计了具有连接酶活性的DNA分子，它能够催化两个DNA片段的连接。同年10月，Usman等人化学合成了一个由14个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA片段，能够较弱地水解RNA磷酸二酯键。三、脱氧核酶(deoxyribozyme)利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段，称为酶性DNA，又称脱氧核酶(deoxyribozyme)。（一）定义具有RNA切割活性；具有DNA连接酶活性；具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性；具有DNA水解活性；具有DNA激酶活性；具有N2糖基化活性；具有DNA戴帽活性。（二）分类•裂解位点为嘌呤、嘧啶连接•双链稳定性越高，酶活性越高•结合臂的长度影响酶催化转换性RNA-DNA比RNA-RNA稳定性差。•对Mg2+,Zn2+,Ca2+,Mn2+有依赖性•组氨酸，精氨酸促进催化活性•极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）（三）脱氧核酶催化特征（一）应用于生命起源的研究四、核酶的应用•生命的起源？•新的观点：生命从RNA开始•体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。（二）在医学领域中的应用•通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。•免疫源性低，很少引起免疫反应•针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。RNA治疗——RNA的修复核酶、反义核酸和小分子RNA（snRNA）是RNA修复的常用工具。核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接。经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子。利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷。（三）在农业等其他领域的应用•防治动、植物病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等。五、核酶技术面临的问题•核酶催化切割反应的可逆性问题•提高催化效率•寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞•使核酶在细胞内有调控地高效表达•增强核酶在细胞内的稳定性•对宿主的损伤问题有待进一步考察