血清总蛋白测定(双缩脲试剂法)

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血清总蛋白测定（双缩脲试剂法）实验日期2014-11-21实验地点第五实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；2、熟悉血清总蛋白的临床意义；3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。二、实验原理（一）：双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。三、材料与方法：实验材料样品：大牛血清试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（0.9%）器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球设备：1100分光光度计、水浴锅实验步骤取3支试管，做好标记(B空白对照，S标准液，U为待测大牛血清)，按下表操作：加入物（ml）B(空白）S（标准）U（待测）大牛血清（1：10）--0.5蛋白标准液（1：10）-0.5-0.9%氯化钠溶液0.5--双缩脲试剂4.04.04.0a.各管混匀，观察各试管颜色b.将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色c.将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm，以空白管调零，测S和U管吸的光度。d.测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管依据公式算出结果四、结果与讨论：（一）：实验结果1、实验现象：a、在实验中首先加入双缩脲试剂，再依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的大牛血清后溶液没有明显的颜色变化，呈淡蓝色透明状；b、水浴20分钟之后，B试管试管显淡蓝色；S试管和U试管显浅紫色且S试管的颜色比U试管的颜色稍深。2、实验数据：管号测定次数平均吸光度123S0.1870.1880.1870.1873U0.1200.1190.1190.11933、结果计算：将大牛血清和蛋白标准液的平均吸光度带入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L),得出结果：血清总蛋白=44.586g/L（二）：结果讨论查阅资料得知，大牛血清总蛋白含量一般为60-80g/L,可是，实验结果却是44.586g/L,即使按照实验要求及步骤操作,结果还是出现了比较大的误差，实验结果经过讨论，分析如下：1、成功的方面：a.在本次试验出现了预期的结果：S和U试管溶液显淡紫色，B试管显淡蓝色。S和U试管显淡紫色是因为蛋白质发生了双缩脲反应，但是由于蛋白质的含量偏少显色较浅，B试管显浅蓝色的原因是B试管中没有发生任何反应，显双缩脲试剂的淡蓝色。b.水浴，吸光度测试等环节都能够按照预定的步骤进行，操作比较严谨。2、误差分析：a.所测得的蛋白质含量偏低，可能是由于样品存储不当，造成待测的大牛蛋白水解，待测样品中的蛋白质总量本身就很低b.待测的大牛蛋白溶液正常，但是，标准蛋白溶液的浓度比标示的高，造成测量结果偏低c.操作过程有偏差，由于量取蛋白质溶液的量比较少，在每个加样步骤的少量偏差，都会造成结果误差较大五：结论样品的蛋白质含量偏低复习思考题1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？双缩脲试剂2.试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后加入？3.简述血清总蛋白测定的临床意义。