肝细胞癌组织PD-L1表达特点及其临床病理特征

-26-论著《肝癌电子杂志》2016年第3卷第3期【摘要】目的探讨PD-L1在肝细胞癌中的表达特点及其表达水平与临床病理学之间的关系。方法选取47例肝移植术后确诊为肝细胞癌的病理标本，对其进行PD-L1免疫组化检测，对PD-L1表达与性别、年龄、大小、分化程度、个数、血管侵犯、肝硬化、血清AFP等临床病理学因素之间相关性进行统计学分析。结果在47例肝癌患者中，13例PD-L1表达阳性（阳性细胞计数＞1%），阳性率为27.7%，几乎全部为免疫细胞表达；肝癌PD-L1表达水平与分化程度有关，分化程度越低，PD-L1表达越高（P＝0.017），但与性别、年龄、大小、个数、血管侵犯、肝硬化、血清AFP等因素均无关。结论肝癌PD-L1表达水平与其他癌种比较中并不算高，其与患者临床病理特征存在一定的相关性。阻断PD-1/PD-L1通路将成为晚期肝癌免疫治疗的新途径，肝癌组织PD-L1可能会成为预测其疗效的生物标志物。【关键词】肝细胞癌；PD-L1；免疫治疗ExpressionandclinicalpathologicalfeaturesofPD‑L1inhepatocellularcarcinomaLIGong,YANGLiu,ZHUXi-Ling(SecondDepartmentofOncology,ClinicalCollegeofGeneralHospitalofArmedPoliceForces,AnhuiMedicalUniversity,Beijing100039,China)Correspondingauthor:LIGong,E-mail:[e-mail]【Abstract】ObjectiveTodiscusstheexpressionofPD-L1inhepatocellularcarcinomaandtherelationshipbetweenPD-L1expressionlevelandclinicalpatologicalcharacteristic.MethodAtotalof47hepatocellularcarcinomapatientswhounderwentlivertransplantwererecruitedintothestudy.Thetissuespecimenswerecollectedandsteinedwithimmunohistochemical.ThecorrletionbetweenclinicalpathologicalfactorsandPD-L1expressionwerestatisticallyanalyzed.ResultsThepositiverateofPD-L1inourstudyis27.7%(13/47),andPD-L1isexpressedinimmunecellsmostly.PD-L1expressionlevelofhepatocellularcarcinomaisassociatedwithdifferentiationdegree(P＝0.017).ConclusionsPD-L1expressionlevelinhepatocellularcarcinomaisnothighcomparedwithothermalignancies,anditisrelevantwiththeclinicalpathologicalcharacteristics.BlockingthePD-1/PD-L1pathwaywillbecomenewmeansofimmunotherapyinadvancedhepatocellularcarcinomaandPD-L1expressioncouldbeapredictivebiomarker.【Keywords】Hepatocellularcarcinoma;PD-L1;Immunotherapy肝细胞癌组织PD-L1表达特点及其临床病理特征黎功，杨柳，朱曦龄（安徽医科大学武警总医院临床学院肿瘤二科，北京100039）通讯作者：黎功E-mail：[e-mail]黎功，硕士研究生导师安徽医科大学武警总医院临床学院肿瘤二科肝癌是严重危害人类生命的恶性肿瘤之一，2012年统计的全球新发肝癌患者约78万，死亡约74万，其中近一半发生在中国。在男性肿瘤患者中，肝癌发生率排在第5位，死亡率排在第2位[1]。手术是唯一可能根治肝癌的手段，但是仅10%～30%的患者适合手术，且术后5年复发或转移率高达50%～70%[2]。晚期肿瘤的治疗，若已发生了远处转移，通常只能采取全身治疗手段，其中化疗和靶向治疗较为常见。然而，肝细胞癌对化疗药物不敏感，唯一被美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批准的靶向药物索拉非尼有效率仅为2%～3%，因此急需寻找新的治疗方式提高肝癌患者的预后[3-4]。近来人们逐渐发现肿瘤的发生发展与机体免疫功能密切相关，并尝试通过调节机体自身免疫系统杀伤肿瘤，肿瘤免疫治疗也被Science杂志评选为2013年度十大科学突破之首[5]。Schreiber等提出的“肿瘤免疫编辑学说”认为，肿瘤细胞经历了清除期、均衡期、逃逸期3个阶段后，将克服机体免疫系统对其的抑制作用，发生免疫逃逸[6]。肿瘤免疫逃逸机制十分复杂，涉及抗原提呈、T细胞活化、T细胞效应、免疫抑制微环境等多个环节，其中PD-1/PD-L1通路就是免疫逃逸的途径之一[7]。目前，FDA批准上市的PD-1单抗-27-论著《肝癌电子杂志》2016年第3卷第3期nivolumab、pembrolizumab和PD-L1单抗atezoliz-umab的适应证已扩大到黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌和膀胱癌等，而nivolumab对晚期肝癌的Ⅰ/Ⅱ期临床研究也表现出不错的疗效[8-10]。作为信号传导B7家族的重要组成部分，PD-L1（又叫B7-H1或CD274）在肿瘤微环境和免疫逃逸中扮演着重要角色。PD-L1主要表达在抗原提呈细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞上，近来发现其在乳腺癌、胃癌、肺癌、食管癌、肝细胞癌等恶性肿瘤细胞中也有表达[11]。PD-L1可与活化T细胞表面PD-1受体结合，抑制T细胞活化增殖，诱导T细胞凋亡，导致局部T细胞免疫耐受，促进肿瘤生长和转移[7]。值得注意的是，在大多数临床试验中，PD-1或PD-L1单抗的疗效多与肿瘤组织中PD-L1的免疫组化表达水平有关，提示PD-L1表达水平可能是预测PD-1免疫治疗疗效的生物标志物[12]。然而，目前有关PD-L1在肝细胞癌中表达的研究较少，其临床病理学特征仍不明确。本研究对47例肝移植术后的肝细胞癌组织切片进行PD-L1染色，探索PD-L1在肝细胞癌中的表达特点及其与临床参数、病理特征之间的联系。1资料与方法1.1资料1.1.1临床资料选取2003年到2009年间在安徽医科大学武警总医院肝移植研究所行肝移植手术的原发性肝癌患者47例，年龄26～69岁，中位年龄48岁；男性40例，女性7例；术后病理诊断均为肝细胞癌。病理分级中～高分化37例，低分化10例；单发肿瘤34例，多发13例；肿瘤最大径＜5cm的有30例，≥5cm的有17例；47例患者中有5例伴有血管侵犯，无肝硬化者仅有2例；术前AFP检测≥400ng/ml的有13例，其余均＜400ng/ml（表1）。没有患者在肝移植手术前接受过免疫治疗。1.1.2主要试剂兔抗人PD-L1单克隆抗体（PD-L1/CD274PolyclonalAntibody）购自美国Proteintech公司（Proteintechgroup，UnitedStates），PV-6000二抗试剂盒购自北京西雅金桥生物有限公司。1.2实验方法1.2.1免疫组化染色采用免疫组化PV-6000二步法。石蜡包埋组织切片3～4μm厚度，经脱蜡和水化后，滴加3%过氧化氢溶液室温作用10min，PBS冲洗3遍，每遍5min，置于pH6.0柠檬酸盐缓冲液中微波加热20min进行抗原修复，自然冷却至室温，PBS冲洗3遍，每遍5min，滴加兔抗人PD-L1单克隆抗体(1：200稀释)，4℃下孵育过夜，PBS冲洗3遍，每遍5min，每张切片滴加二抗50μl，室温条件下孵育20min，PBS冲洗3遍，每遍5min，在每张切片上滴加100μlDAB显色剂，室温下避光显色，在光学显微镜下控制显色时间，3～5min后蒸馏水冲洗终止显色。苏木精复染1min，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察成像。1.2.2免疫组化判定标准所有PD-L1免疫组化染色切片均送至外院由2位病理学专家独立阅片。在×10倍镜下对全片染色进行初评后，随机选取5～10个×20倍镜视野（尽量避免坏死区域）进行评分。“-”代表阳性细胞比例＜1%；“+”代表阳性细胞比例＞1%；“++”代表阳性细胞比例＞50%。按染色的强度，阴性染色记为0分，弱阳性染色记为1分，中度阳性记为2分，强阳性记为3分。1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计学分析。计数资料采用Fisher'sExactTest费舍尔精确概率法，以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1肝癌PD-L1染色结果在47例病理确诊为肝细胞癌的病理染色切片中，13例PD-L1表达阳性，34例阴性，阳性率为27.7%。在PD-L1表达阳性的13例患者中，按本研究判定标准仅1例染色为“++”（阳性细胞比例＞50%），其余12例染色均为“+”（阳性细胞比例＞1%）。在染色强度上，阳性细胞染色强度多为中等，未做进一步细分。本研究中PD-L1染色阳性细胞几乎全部为免疫细胞，浸润肿瘤、侵袭前沿或分布在癌旁间质区及肝窦处，仅1例阳性细胞为肿瘤细胞（图1）。2.2肝癌PD-L1表达与临床病理关系该研究表明PD-L1表达与肝癌的分化程度有关，低分化者PD-L1阳性率为60%（6/10），而中～高分化者阳性率仅为18.9%（7/37），差异有统计学意义（P＝-28-论著《肝癌电子杂志》2016年第3卷第3期0.017，Fisher'sexacttest）。在性别方面，男性患者PD-L1阳性率为22.5%（9/40），女性患者阳性率为57.1%（4/7），差异无统计学意义（P＝0.08，Fisher'sexacttest）。同样，年龄、肝硬化、肿瘤大小、肿瘤个数、血管侵犯及血清AFP水平与PD-L1表达均无关（表1）。免疫在抗肿瘤中发挥着重要作用，经过抗原提呈，T细胞活化、转移和浸润后，活化T细胞能够特异性识别并杀伤肿瘤细胞[13]。然而，PD-1/PD-L1通路的存在使活化T细胞失去了这一功能，PD-1单抗则可通过抑制此通路恢复浸润T细胞的活性[7]。最新研究结果显示，Nivolumab单药对晚期肝细胞癌的有效率为16%，其中2例肿瘤完全消失，远远优于索拉非尼，另外还有51.8%的患者肿瘤稳定不进展，6个月和9个月的生存率分别为82.5%和70.8%，证实了阻断PD-1/PD-L1治疗肝细胞癌的临床获益[9,10]。Pembrolizumab在黑色素瘤和非小细胞肺癌的疗效上也已经表现出与肿瘤组织PD-L1表达水平密切相关[12]。然而，当前对PD-L1的免疫组化染色并没有统一的判定标准，不同研究的判定标准也各不相同，主要有阳性细胞计数、染色强度以及二者结合3种方式（表2）。Shen[14]、Kan[15]、Calderaro[16]都是以细胞计数为判定标准，其中Shen将“-”、“+”、“++”、“+++”分别定为细胞计数＜10%、10%～40%、40%～80%、＞80%；Kan则分别为细胞计数＜10%、10%～25%、25%～50%、＞50%，而Calderaro则简单的将＞1%定为阳性。Umemoto[17]仅以染色强度为判定标准，弱阳性定为“+”，中等阳性定为“++”，强阳性定为“+++”。Gao[2]、Wu[18]、Wang[19]则将细胞计数及染色强度结合起来评价。本