植株生理生长指标的测定

植株生理生长指标的测定根系活力的测定（TTC法）植株根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部分的生长、营养状况及产量水平。一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂（一）材料水培或砂培小麦、玉米等植物根系。（二）仪器设备1.分光光度计；2.分析天平（感量0.1mg）；3.电子顶载天平（感量0.1g）；4.温箱；5.研钵；6.三角瓶50ml；7.漏斗；8.量筒100ml；9.吸量管10ml；10.刻度试管10ml；11.试管架；12.容量瓶10ml；13.药勺；14.石英砂适量；15.烧杯10ml、1000ml。（三）试剂1、乙酸乙酯（分析纯）。2、次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。3、1％TTC溶液：准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。4、0.4％TTC溶液：准确称取TTC0.4g，溶于少量水中。定容到100ml。5、磷酸缓冲液（1/15mol/L，pH7）：6、1mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。7、0.4mol/L琥珀酸：称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、实验步骤1、定性测定植株生理生长指标的测定（1）配制反应液：把1%TTC溶液、0.4mol/L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1~3h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。2、定量测定（1）TTC标准曲线的制作取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算单位质量鲜根的四氮唑还原强度[mg/(g∙h)]=𝐶𝑊×𝑡C—从标准曲线查出的四氮唑还原量（mg）；W—样品质量（g）；t—反应时间（h）。植株生理生长指标的测定植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（nitratereductase,NR），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（NO3ˉ+NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O）。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以μg氮/（g·h）为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定；离体法复杂，但重复性较好。Ⅰ离体法一、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料水稻、小麦或其他植物叶片、幼穗等。（二）试剂1、亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5mL定容至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。2、0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O30.0905g与NaH2PO4·2H2O2.4965g加无离子水溶解后定容至1000mL。3、1％磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100mL浓度为3mol/L的HCl中（25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/LHCl）。4、0.02％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。5、0.1mol/LKNO3溶液：2.5275gKNO3溶于250mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。6、0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液：8.8640gNa2HPO4·12H2O，0.0570gK2HPO4·3H2O溶于1000mL无离子水中。7、提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸、0.0372gEDTA溶于100mL0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液中。8、2mg/mLNADH溶液：2mgNADH溶于1mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液中（临用前配制）。（三）仪器设备冷冻离心机，分光光度计，天平（感量0.1mg），冰箱，恒温水浴，研钵，剪刀，离心管，具塞试管，移液管，洗耳球。植株生理生长指标的测定二、实验步骤（一）标准曲线制作取7支洁净烘干的15mL刻度试管按表1顺序加入试剂，配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（μg）为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y）建立回归方程。表1配制标准溶液时各物质加入量试剂/mL管号1234567亚硝酸钠标准液00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.40.01%磺胺44444440.02%萘基乙烯胺4444444每管含亚硝态氮/μg00.20.40.81.21.62.0（二）样品中硝酸还原酶活力测定1、酶的提取称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置冰浴中加少量石英砂及4mL提取缓冲液，研磨匀浆，转移于离心管中在4℃、4000r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。2、酶的反应取粗酶液0.4mL于10mL试管中，加入1.2mL0.1mol/LKNO3磷酸缓冲液和0.4mLNADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液代替。3、终止反应和比色测定保温结束后立即加入1mL磺胺溶液终止酶反应，再加1mL萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心5min，取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（μg）。三、结果计算样品中硝酸还原酶活性[𝜇𝑔/(𝑔∙h)]=𝑥𝑉𝑆×𝑉𝑇𝑊×𝑡植株生理生长指标的测定x—反应液酶催化产生的亚硝态氮总量（μg）；VT—提取酶时加入的缓冲液体积，mL；VS—酶反应时加入的粗酶液体积，mL；W—样品鲜重，g；t—反应时间，h。Ⅱ活体法一、材料、仪器设备及试剂（一）实验材料水稻、小麦或其他植物叶片、幼穗等。（二）试剂1、亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5mL定容至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。2、1％磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100mL浓度为3mol/L的HCl中（25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/LHCl）。3、0.02％萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。4、0.1mol/LKNO3溶液：2.5275gKNO3溶于250mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。5、30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸，水溶后定容至100mL。（三）仪器设备真空泵、真空干燥器、小烧杯、玻璃瓶塞、其他用具同离体法。二、实验步骤（一）标准曲线制作：同离体法（二）酶反应及活性测定1、取样：称取作物叶片1.0~2.0g4份，剪成1cm左右的小段，放于小烧杯中，用直径略小于烧杯直径的玻璃瓶塞将材料全部压于杯底，其中1份作对照，另外3份做酶活性测定用。2、反应：先向对照管中加入1mL30%三氯乙酸，然后各管中都加入9mL0.1mol/LKNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气1min再通入空气，再抽真空，反复几次，以排除组织间隙的气体，至叶片完全软化沉入杯底，以便底物溶液进入组织。最后通入氮气密封后，在25℃黑暗中反应30min，再分别向测定管（对照管除外）加入1mL30%三氯乙酸终止酶反应。植株生理生长指标的测定3、比色测定：将各管摇匀静置2min后，各取2mL反应液，加入1mL磺胺和1mL萘基乙烯胺，摇匀显色15min后，于4000r/min下离心5min，取上清液于540nm处测其吸光度。根据标准曲线计算出反应液中生成的亚硝态氮总量（μg）。三、结果计算同离体法。植株生理生长指标的测定叶绿素含量的测定一、原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和叶层厚度L成正比，即：A=αCL式中：α为比例常数，当溶液浓度以百分浓度为单位，叶层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素a，叶绿素b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a，叶绿素b和类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a，叶绿素b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。已知叶绿素a，叶绿素b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，已知在波长663nm下，叶绿素a，叶绿素b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：𝐴663=82.04𝐶𝑎+9.27𝐶𝑏（1）𝐴645=16.75𝐶𝑎+45.60𝐶𝑏（2）式（1）、（2）中的A663和A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度，Ca、Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度，以mg/L为单位。解方程组（1）、（2）得：𝐶𝑎=12.72𝐴663−2.59𝐴645（3）𝐶𝑏=22.88𝐴645−4.67𝐴663（4）将Ca与Cb相加即得叶绿素总量CT𝐶𝑇=𝐶𝑎+𝐶𝑏=20.29𝐴645+8.05𝐴663（5）另外，由于叶绿素a、叶绿素b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素a、叶绿素b总量：𝐶𝑇=𝐴652×100034.5（6）植株生理生长指标的测定在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：𝐶𝑎=12.21𝐴663−2.81𝐴646（7）𝐶𝑏=20.13𝐴646−5.03𝐴663（8）𝐶𝑥∙𝐶=1000𝐴470−3.27�