扩增基因全长实验技术

扩增基因全长实验技术获取基因全长简介基因初步验证基因全长获取（RACE技术）RACE产物鉴定4123以介绍5’RACE技术为主5对序列进行生物信息学分析目录为什么要获取基因全长？什么是EST？获取基因全长基本流程？获取基因全长简介EST(ExpressedSequenceTag)表达序列标签—是从一个随机选择的cDNA克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20到7000bp不等,平均长度为360±120bp。获取全长cDNA是研究基因功能的关键，是进行基因功能及产物分析的必要前提。获取基因全长基本流程构建数据库筛选EST序列普通PCR进行初步验证RACE技术生物信息学分析库筛选EST基因初步验证获取基因全长进行全序列分析以本实验室具体情况为例子生物信息学分析1.Blast比对2.ORF比对3.相似序列多重比对4.家族成员多重比对PCR扩增凝胶回收测序•设计引物•提取RNA•反转录•PCR扩增Ⅰ电泳检测Ⅱ凝胶回收Ⅲ电泳检测Ⅳ克隆PCR产物测序凝胶回收测序克隆后菌液测序克隆后质粒测序基因初步验证RACE技术方法RACE简介试剂盒选取5’RACE原理实验过程基因全长获取cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法。分为3’RACE和5’RACERACE简介Clontech公司全称：SMARTRACEcDNAamplificationkit优点：操作简便，成功率较高，全长分子的比例较高价钱：中等偏上。缺点：不知道能否拿到完整的5’UTR.试剂盒选取5’RACE原理5’polyA3’Oligo(dT)primer5’polyA3’cDNA第一条链合成机制polyA3’polyA3’3’5’5’RACE原理polyA3’5’3’LUPSuppressionPCR:阻抑聚合酶反应5’3’5’3’3’5’GSP13’GSP1SUP5’5’3’5’3’实验过程合成cDNA第一条链（1）制备A管：加好后放在室温下。共计4ul。2.0ul5XFirst-StrandBuffer1.0ulDTT(20mM)1.0uldNTPMix(10mM)4.0ulTotalVolume（2）制备B管：冰上操作。1.0-2.75ulRNA1.0ul5'-CDSPrimerA再加入无菌水，使体积达到3.75ul。混合溶液，并用掌上离心机离心。72℃3分钟，42℃2分钟。此过程可在PCR仪中进行。之后14000g离心10s。如果是做5’RACE，则加入1ulSMARTerIIAoligo。此时B管体积为4.75ul。实验过程合成cDNA第一条链（3）在上一步放入PCR仪中后，在之前放在室温下的A管中加入：（室温进行）0.25ulRNaseInhibitor(40U/μl)1.0ulSMARTScribeReverseTranscriptase(100U)加上之前A管中的4ul，此时总体积为5.25ul。（4）将A管中的混合液体5.25ul加入到B管4.75ul中。使体积达到10ul。缓慢吸打混合，离心至管底部。之后将管放在PCR仪中42℃90分钟。70℃10分钟。（5）在管中加入Tricine-EDTABuffer100ul。（在总RNA的浓度≥200ng时）-20℃保存3个月。RACEPCR每50ul的体系中先合成41.5ul的MasterMix:34.5ulPCR-GradeWater5.0ulHiFiPCRBuffer1.0uldNTP1.0ulHiFiMix实验过程PCR反应体系：5’RACEreadycDNA:2.5ulUPM（10*）：5ulGSP1（10uM）：1ulMasterMix：41.5ulTotal：50ul实验过程RACEPCRPCR反应程序：94℃3min30cycles94°C30sec68°C30sec72°C3min72℃10min4℃+∞4种方法凝胶回收对PCR产物进行凝胶回收，确认片段大小，对回收产物进行测序。产物位置、大小比较GSPs和NGSPs作为引物时扩增得到的产物。克隆测序对RACE产物进行克隆测序，建议选取8-10个克隆进行测序。SouthernBlot对Southern杂交结果进行分析RACE产物的鉴定谢谢