罗氏高通量荧光定量PCR技术

罗氏高通量荧光定量PCR技术平台--------从基因表达到遗传突变分析的更多解决方案目标分子研究流程：转录和转译水平基因：遗传信息的载体SamplesRNA/DNAcDNA/cRNA/DNASpecificDNA目标分子的基因组/表达水平流程蛋白质：生命活动的执行者SamplesRNA/DNAcDNA/cRNA/DNASpecificDNAmRNASpecificProtein目标分子的转译水平流程转录翻译高通量测序/芯片平台MethylationSNPmiRNASpliceVariantsCNV………..基因组学转录组学蛋白组学细胞组学代谢组学结构组学•基因位点突变•甲基化表观遗传学研究•表达差异性研究•表达调控研究•蛋白质结构化学•蛋白质功能/相互作用荧光定量PCR技术平台和生命科学研究课题：切入点？荧光定量PCR技术平台发展：应用领域PCRqPCRHRMHTP•1990s•2000s•2006Overthepast10years,thepopularityofthismethodhasgrownexponentially,withthepublicationofwellover25,000papersfromdiversefieldsofscience,includingagricultural,environmental,industrial,andmedicalresearch,makingreferencetoRT(reversetranscription)-qPCRdata.Taylor,S.etal.Methods50,S1-S5(2010)ClinicBenchSurveillanceDiagnosticsDiscoveryResearchRocheApplied-scienceLightCycler：应用方向和解决方案•MIQEguidelines•Normalization•Validatereferencegeneempirically•Multiplexing•SinglecellqPCR•HTPgeneexpressionprofiling(384-microplate,micro/nano-fluidics)•DeletionorInsertion•Mutation•SNPdetection•Methylation•GMOdetection•GeneExpression•Genespillover•ComplementaryautomationtechnologiestosupportHTPapplicationsDNADosageMolecularMarkersQualityControlNewFrontiers•MIQEGuideline：qPCR实验的标准化流程•目标基因分子的定量/定性分析•内参基因的选择•遗传突变/基因型分析•蛋白质相互作用QualityControl–MIQEGuidelines：qPCRisamultistepassayStephenA.Bustin,Methods50(2010)217–226Proposedachecklistthatcontains85parameterstoassurequalityresultsCitedby300articles(tillJul2011)基因表达-体系优化：一步法还是两步法？•一步法RT-PCR:在同一个管中实现反转录(RT)和PCR过程–一管反应（操作便捷,污染几率小）–快速–需要特异基因引物•两步法RT-PCR：在不同管中实现反转录(RT)和PCR过程–一次反转录，一个cDNA库，多重PCR扩增–多种引物选择(oligodT,randomhexamers,targetspecific)–实现长PCR的扩增（cDNA）引物和探针设计：基于染料法（SYBRGreenI）的引物设计•引物退货温度：60°C；PCR产物长度：100–250bp•借助引物设计软件例如：Primer3（）•HPLC纯化•跨内含子设计（mRNA检测）Length：（8-9）nt，7000条转录本/perprobeReporter：FAMQuencher：LowBackgroundLNA（LockedNucleicAcidTechnology)：锁定核苷酸技术核苷的2、4位形成环氧亚甲基桥结构，提高探针Tm值引物和探针协作跨内含子免费设计网站：(UniversalProbelibrary)通用探针库：定量分析的最佳工具UPL(UniversalProbelibrary)通用探针库：如何工作？通用性好每条探针识别7000条转录本,每个转录本至少被16条探针识别从转录组中挑选8-9bp长度的寡核苷酸片段UPL(UniversalProbelibrary)通用探针库：LNA锁定核苷酸技术提高Tm值ProbeTargetPerfectmatch3’-acgaccac-5’Singlemismatch3’-acggccac-5’TmDNA8-mer5’-tgctggtg-3’Tm=35°CTm=25°C10°CLNA8-mer5’-TGCTGGTG-3’Tm=71°CTm=45°C26°C高Tm值符合qPCR反应要求；具有更佳的单碱基错配识别能力primerUPLprobeprimer引物和探针协作实现PCR反应的高特异性UPL(UniversalProbelibrary)通用探针库：在线设计-特异（UniversalProbeLibrary）通用探针库：实验流程第一天登陆网站设计实验获取信息（引物序列和探针号）订购引物第三天收到引物取出探针定量试验Convenience：165种探针库Cheapness：～1.0RMB/perreactionSpecificity：荧光信号取决于引物和探针的协作InternalControl：兼容内参基因的双色检测UPL(UniversalProbelibrary)：通用探针库特点165种特异探针可以定量检测大多数生物体的几乎所有转录本90个生物体特异的探针可覆盖以下生物体种类:人类，小鼠，大鼠，灵长类，果蝇，线虫，拟南芥，玉米，斑马鱼UPL(UniversalProbelibrary)：通用探针库覆盖率TotalAssaysAvailableUniversalProbeLibraryCoverageHuman63950099%Mouse50950099%Rat36400098%Primates51950096%Drosophila25350099%Arabidopsis19900098%C.elegans13400095%Total261900090real-timePCR探针+网上免费设计工具+灵活性、特异性、通用性UPL(UniversalProbelibrary)：通用探针库质控可以作为判断实验结果的标准之一•无模板质控(NTC)无模板，包含所有PCR反应因素–监控核酸污染–监控引物二聚体形成（SYBRGreenIassays）•阳性质控阳性样本，实现目标基因的对照扩增–体系优化初期(特异性,灵敏性,扩增效率确定)•阴性质控阴性样本，对于目标基因无任何扩增结果–确定PCR反应的特异性反应条件：模板PCR反应核酸模板需要纯化，无PCR抑制子•模板浓度新体系优化时候，建议进行倍比稀释进行后续优化–GenomicDNA:≤50ng–PlasmidDNA:≤106拷贝–cDNA:≤50ng相当于等量的总RNA–RNA:≤500ng总RNA或者100ngmRNA•核酸模板存储–高浓度，分装保存–低浓度模板保存，使用硅管，加入一些核酸载体，譬如：MS2RNA噬菌体(核糖核酸)反应条件：引物和探针浓度选择（终浓度）•引物:0.1µM–1.0µMeach•探针:0.1µM–0.5µM常规浓度（终浓度）•引物:0.5µMeach•探针:0.2µM例子:UniversalProbeLibraryassay•更高的引物/探针浓度可以得到更高的信噪比（荧光强度更高）•浓度差异不大，对于Cp值影响较小SYBRGreenI检测模式：熔解曲线方式判断特异性扩增曲线熔解曲线的产物分析低丰度样本扩增产生引物二聚体SYBRGreenI检测模式：提高特异性采用合适的温度点进行荧光采集，避免引物二聚体干扰注意点:引物二聚体会干扰PCR扩增效率；不同的引物会产生不同的扩增结果PCR扩增判断因素：体系灵敏度,扩增效率,重复性反应灵敏性=检测局限性PCREfficiency=PCRQuality影响因素:•引物设计,引物退火•片段长度,扩增序列和GC含量•样本纯度,抑制子•cDNA合成效率•PCR程序•PCR反应成分标准曲线:•阳性/质控样本倍比稀释和技术性重复体系优化–分析：总结•扩增曲线分析–PCR灵敏度和扩增效率–特异性(探针法)•熔解曲线分析–SYBRGreenI:特异性产物分析（熔解曲线峰判断）–杂交探针和单探针:SNP分型–高分辨率熔解曲线:未知突变检测•其他分析方法(可选l)–凝胶电泳检测:PCR产物大小,引物二聚体,非特异性产物–测序:仅适合特定的应用领域，例如：基因扫描检测•MIQEGuideline：qPCR实验的标准化流程•目标基因分子的定量/定性分析•内参基因的选择•遗传突变/基因型分析•蛋白质相互作用绝对定量典型应用领域:•特定物种鉴定(e.g.bacteria,virus)•特定核酸样本检测(e.g.oncologyresearch)•检测病原体载量(e.g.legionella,anthrax)•筛选抗生素抗性基因(e.g.MRSA,VRE)•水质监测…RelativeQuantification典型应用领域:•mRNA表达水平的检测(e.g.细胞因子,肿瘤)•基因定量(e.g.染色体缺失)•研究疾病的微小残留病灶(MRD)•GMO检测…相对定量RocheApplied-scienceLightCycler：DNADosageRocheApplied-scienceLightCycler：DNADosage实时定量PCR定量原理绝对定量相对定量外部标准曲线(单色)外部标准曲线(无校准样本)校准样本归一化方法无效率矫正有效率矫正外部标准曲线带内对照(双色)基因定量表达和分析标准曲线(外标准或内标准)未知标本•CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)n•log(F2/F1)n•log(F2/F1)TargetRocheApplied-scienceLightCycler：DNADosage绝对定量分析过程•FluorescenceCycles参考序列•FluorescenceCycles目标序列未知样本•标准样本•Cycles•Fluorescence目标序列标准曲线参考序列标准曲线•Cycles•Fluorescence•CrossingPointLogConcentration•CrossingPointLogConcentration结果=目标序列浓度参考序列浓度RocheApplied-scienceLightCycler：DNADosage相对定量分析过程绝对定量与相对定量•已知浓度样品做标准曲线•计算出未知样品的浓度值简单相对定