槐米中芦丁的提取与分离(建大)

槐米中芦丁的提取与鉴定一、摘要：芦丁是一种分布广泛的黄酮类化合物。目前主要用于治疗毛细血管脆性减弱和渗透性增强所致的出血，芦丁还可降低人体血脂和胆固醇并具有抗菌和抗放射作用。国外主要用作食品、化妆品的添加剂和着色剂。文献报道的槐米中提取芦丁的方法较多。本实验通过煮沸槐米与水的混合物得到粗芦丁的水溶液，然后利用硅胶色谱柱法得到产物芦丁。关键词：槐米芦丁硅胶色谱柱层板二、引言芦丁（Rutin）又称芸香苷，广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物SophorajaponicaL的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高(含量可达12-16%)，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水形成的苷。芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有3分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；沸水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液，酸化后又可析出，因此，本实验采用碱提取酸沉淀法提取芦丁。芦丁具有维生素P样作用。能维持血管的正常通透性，减低血管的脆性，缩短流血时间，可作为高血压病的辅助治疗剂。亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。三、实验仪器与试剂【仪器】紫外灯蒸馏装置一套250ml烧杯（一只）500ml烧杯（两只）100ml三角瓶（一只）纱布色谱柱（Ф1.5×30cm）玻璃板（5×20cm3片2.5×7.58片）【试剂】硅胶层析用聚酰胺（60~100目）甲醇70%工业乙醇槐米芦丁标准样四、实验内容与步骤1.芦丁的提取将粉碎好的槐米12g倒入500ml烧杯中，加沸水150ml，煮沸1h（在煮沸的过程中，可补加水），趁热用纱布过滤，残渣中加入100ml水，再煮沸30min，共进行两次，将两次滤液合并，放置，冷却。即有大量黄色沉淀生成，抽滤。①提取150ml沸水，12g槐米煮沸，1h合并滤液1000ml沸水，煮沸30min得粗产品2.芦丁的提纯将以上得到的粗芦丁纯品约1g，加甲醇5~8ml，使之溶解，再加柱层析用硅胶（60~100目）3~4g，用刮刀轻轻搅拌，在水浴上赶去甲醇（通风橱内进行），待用。将色谱柱垂直大部分在铁架台上，关闭柱塞（不要涂油脂），加蒸馏水约至250ml烧杯纱布过滤滤渣纱布过滤冷却抽滤色谱柱一半高，将1g层析用聚酰胺（60~100目）倒在烧杯中，加蒸馏水50ml，轻轻转摇拌和均匀（不要用搅棒搅动，防止颗粒太细），再打开柱塞使柱内不断流出的同时，把烧杯内聚酰胺缓缓加入，边加边用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲打色谱柱，使填料装填均匀，无气泡。当色谱柱顶部下降到距聚酰胺层高约1.5cm时，关闭柱塞。将上述拌好硅胶的粗芦丁样品加入柱内，用刮刀轻轻铺平，勿有气泡，再盖上剪好的圆形滤纸。用70%工业乙醇洗脱，当有淡黄色的液体从柱下流出时开始收集洗脱液，每次约25ml，共6瓶，依次编好接收瓶号。取2.5×7.5cm的硅胶G板，每板上点芦丁标准样与接受瓶中的溶液，放入层析缸中，加盖，进行展开（展开剂为：乙酸乙酯：丁酮：甲酸：水=5:3:3:1,当展开剂前沿距板端约1cm时，去出，晾干。②硅胶涂板于研钵中研细③提纯3-4ml甲醇1g柱层析硅胶适量去离子水敲打70%乙醇上样点板冷却抽滤在紫外灯下观察斑点，将只含芦丁的接受瓶溶液合并入一圆底烧瓶中，蒸馏，3g硅胶7ml0.7%CMC涂片自然晾干烘箱110℃30min0.8g粗品溶解拌匀挥干甲醇备用5g聚酰胺装柱洗脱每瓶25ml蒸馏浓缩晾干得产品蒸去大部分溶剂后（约留25ml溶液），趋热倾入一只100ml的三角瓶内，冷却即有芦丁析出，抽滤，晾干，计算收率。五、结果与讨论芦丁粗产品M=0.7g芦丁纯产品m=0.4g收率η=m/M*100%=57%六、附录1.层析的基本知识层析（chromatography）是“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。层析利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。色谱法：利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱法本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。2.柱上层析上一个上层析是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。本实验成败的关键是：装柱要紧密，要求无断层、无缝隙；在装柱、洗脱过程中，始终保持有溶剂覆盖吸附剂；一个色带与另一色带的洗脱液的接受不要交叉。七、问题与讨论1、为什么从槐米中提取芦丁时开始不能加冷水慢慢煮沸，而要直接加沸水提取？答：避免在提取过程中黄酮苷类化合物发生分解，故用沸水事先破坏其酶的活性。2、芦丁和其甙元槲皮素在聚酰胺柱色谱上用70%工业乙醇洗脱时，哪个先被洗脱下来？答：聚酰胺是一种常用的吸附剂，其分子中存在许多酰胺键，可与酚类酸类醌类硝基类化合物形成氢键缔合而产生吸附作用；又由于不同结构的化合物与聚酰胺形成氢键的能力不同因而产生的吸附力大小也不相同，所以聚酰胺特别适合用来分离上述化合物。芦丁和槲皮素均属于黄酮类化合物，前者为黄酮苷，后者是其苷元，芦丁分子中有4个酚羟基能与聚酰胺形成氢键，二槲皮素分子中则有5个羟基能与聚酰胺形成请柬，因此后者比前者吸附更牢固。选用乙醇进行洗脱，芦丁先出柱，槲皮素后出柱，从而达到分离的目的。八、注意事项1.柱子不要装太紧实，应均匀无气泡，柱上层留一段水柱；2.搅拌时应轻轻搅拌，不要太剧烈；3.制作G板时要使板充分涂抹均匀，将湿品芦丁烘干时应充分注意，小心芦丁被氧化。九、参考文献1.新姚生.《天然药物化学》人民卫生出版社，2002.2.李捃.《综合化学实验》西北大学出版社，2003.