10.mrsa耐药机制及治疗进展

1文献阅读报告06耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药机制及治疗进展凡对甲氧西林、苯唑西林、头孢拉定耐药或Mec基因阳性的金黄色葡萄球菌定义为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicilinresistantstaphylococcusaureus,MRSA)。随着抗生素的广泛应用和滥用,MRSA的感染率也在逐年增高。欧洲的感染率普遍达到40-60%，澳洲Alford医院血培养分离的金葡中，MRSA高达60-75%。美国NNIS报道1975年182所医院MRSA占金黄色葡萄球菌感染总数的2.4%，1991年上升至24.8%。而日本Kansai医科大学附属医院MRSA的分离率1993年达到41%。国内在70年代发现有MRSA，北京医科大学附属医院1996年分离MRSA达58.3%，近几年MRSA的检出率正在逐年上升，国内多家医院报道MRSA达到53.88-84.6%，已成为院内感染的重要病原菌之一。[1]因而，MRSA感染、乙型肝炎和获得性免疫缺陷综合征同时列为世界上最难解决的三大感染性顽症。1MRSA的特性1.1MRSA的生物学特性[2]MRSA为直径约1μm的球状细菌,易于存在于呼吸系统及皮肤表面,属革兰阳性、溶血性、兼性厌氧菌,过氧化氢酶阳性,氧化酶阴性。它可在15～45℃生长,并可在15%的NaCl溶液中生长。据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准,MRSA的最低抑菌浓度(MIC)≥16μg/ml,而MSSA为MIC≤8μg/ml。MRSA可导致一系列的化脓性感染,食物中毒及中毒休克综合征。其化脓性感染从小的皮肤病变如疖、痈到严重的感染如肺炎、乳腺炎、静脉炎、脑膜炎、泌尿系统炎症,并可到达深部引起骨髓炎、心内膜炎等。MRSA是医院感染的一种严重病原菌,常见于外伤或手术后,体内留置的导管周围。MRSA还可通过向食物中排出肠毒素而引起食物中毒,向血液中释放超级抗原而引起中毒休克综合征。MRSA感染致病后常在局部或全身引起非特异性炎症反应,并可引起难以控制的致命的败血症。1.2异质性MRSA和普通的金葡菌相比具有异质性，MRSA菌落内细菌存在敏感和耐药两个亚群，即一株MRSA中只有一小部分细菌约万分之一到2千万分之一，对甲氧西林高度耐药，在50μg/ml甲氧西林条件下尚能生存，而菌落中大多数细菌对甲氧西林敏感，在使用抗生素后的几小时内大量敏感菌被杀死，但少数耐药菌株却缓慢生长，在数小时后又迅速增殖。1.3体外培养的特殊性MRSA的最佳生长条件：0.5麦氏标准菌液，M-H培养基，温度33～35℃，NaCl添加浓度5%（1997年NCCLS推荐4%，考虑到异质性MRSA，现在改为5%)，孵育时间24小时。2006版NCCLS推荐用头孢西丁替代苯唑西林做药敏试验，温度绝不能超过35℃，以免漏掉异质性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(hetero-MRSA)。1.4广谱耐药性MRSA除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量对氨基苯甲酸（PABA）等不同机制，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，近几年世界各地都有对万古霉素耐药的报道，MRSA的多重耐药性是全球性的棘手难题。2MRSA的耐药机制[1]MRSA的耐药性来源,一方面,是由于质粒介导产生的β2内酰胺酶,属获得耐药,来源为DNA的转导、转化、或其他类型的DNA插入。另一方面,是由染色体DNA介导的固有耐药性,主要是由于mec基因编码的PBP2a的耐药性。近年来对这一方面研究较多。2.1MLS（大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素类）的耐药机理以上三类药物的作用机理是结合到菌体内核糖体的50s亚基，阻止细菌蛋白的合成，有效抑制细菌生长。耐药的原因主要有两点：第一，质粒和染色体的DNA中含有Tn554转座子，可以编码红霉素耐药基因和大观霉素耐药基因，红霉素耐药基因有ermA、ermB、ermC，这三种基因介导的23SrRNA甲基化酶，甲基化酶修饰后的核糖体不能与MLS结合；第二种耐药情况是由msrA介导的依赖ATP泵作用，使药物主动流出，导致胞内药物浓度低，不能与核糖体有效结合，从而耐药。2.2氨基糖甙类的耐药机理此类药物通过能量转换系统进入细胞内，最终与核糖体16s亚基结合，抑制蛋白质的合成。1944年氨基糖甙类开始用于临床治疗金3葡，不到十年就有耐药报道。耐药机制主要有三种：（1）药物作用靶位-16srRNA基因突变，改变了与核糖体的结合。（2）无效转运，药物不能进入细胞内，大多数低水平交叉耐药属于此类。（3）细菌获得氨基糖甙类修饰基因，所表达修饰酶钝化氨基糖甙类药物，该类修饰酶有aac(乙酰转移酶类)、aph(磷酸转移酶类)、ant(核苷转移酶类)，使药物不能与核糖体结合从而表现为耐药，多数以转座子、整合子和质粒这些可移动的遗传物质介导，易于传播而常见。2.3β-内酰胺类的耐药机理MRSA的耐药机制是非常复杂的，目前公认的是由于细菌获得的mecA基因编码的葡萄球菌青霉素结合蛋白(PBP2a)引起的。PBPs是一组位于细菌内膜，具有催化活性的D肽酶，催化细菌细胞壁肽聚糖的转肽反应，普通金葡产生PBP1，PBP2，PBP3，PBP4四种酶，这些PBPs与β-内酰胺抗生素有很高的亲和力，是该类药物的作用靶点。当药物浓度达到MIC时，PBPs失活，导致细菌细胞壁合成障碍，细菌无法存活。PBP2a是葡萄球菌青霉素结合蛋白PBP的异构体，与药物亲和力很低，因而保持活性，并能替代PBPs的生物合成功能，从而显示耐药性。导致MRSA耐药的另一原因是正常的PBPs基因修饰或过量的β-内酰胺酶的产生，在抗生素选择压力下原有产生PBPs的基因发生突变，导致这些PBPs与β-内酰胺抗生素的亲和力下降而表现为耐药；过量的β-内酰胺酶能微弱水解大多数的β-内酰胺抗生素，使抗生素失活而表现为耐药,但这种原因引起的往往为低水平或临界性耐药，所占比例很少。由于PBP2a具有高度保守性，临床实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI，以前称NCCLS）规定，一旦金黄色葡萄球菌检出mecA基因或者PBP2a蛋白即可确定MRSA。2.4喹诺酮类的耐药机理[3]喹诺酮类药攻击靶点是细菌的DNA螺旋酶，当喹诺酮类药物抑制DNA螺旋酶活性时也阻止了细菌DNA复制、修复、染色体分离、转录等一系列的功能，从而达到了杀菌的功能。耐药原因是逐步获得的染色体突变引起的，金黄色葡萄球菌DNA螺旋酶gyrA亚基上的喹诺酮类药物的耐药区（QRDR）是位于残基暗68-107区域，其中84～88区域的突变与耐喹诺酮类药物关系最为密切。在药物的压力下，ser-84最易发生突变。喹诺酮类药物的耐药基因发生在染色体上。金黄色葡萄球菌耐喹诺酮类药物还与膜蛋白NorA有关。NorA的活性依赖于跨4膜的质子梯度，NorA可能是一个对输蛋白，导致喹诺酮类药物与质子对输，即方向相反的跨膜运动，对亲水性药物亲和力较高，可以排出氟哌酸、氯霉素等不同结构的化合物，当NorA含量增高时，易产生喹诺酮类耐药。2.5糖肽类的耐药机理万古霉素属于多肽类抗生素，来自东方链霉菌或土壤丝菌属的高分子量的糖肽类抗生素,其对革兰阳性菌的作用机制，主要是通过干扰肽聚糖合成的前体物质五肽链上D-Ala-D-Ala，并与之形成复合物，阻断肽聚糖合成中的转糖基酶、转肽酶以及D-D羧肽酶作用，而抑制细菌细胞壁的合成，使菌体死亡。50年代末，该药以其对耐青霉素葡萄球菌的良效而问世，成为当时抗G+菌，如金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌等强力的“王牌”抗生素。虽然万古霉素对MRSA是最敏感的药物，但由于万古霉素在人类中以及其它糖肽类抗生素在动物中的广泛应用，导致了耐万古霉素肠球菌（VRE）的出现。体外试验已经证明：对万古霉素的高度耐药性可由屎肠球菌迅速向金葡萄转移，，耐药机制研究现在比较认可细胞壁增厚与VanA基因的影响，当然可能受到多因素的影响，有待进一步的研究。3MRSA的检测方法[2]传统方法有:(1)苯唑西林2盐平板筛选法、纸条扩散法和E实验:使用自动分析仪检测MRSA,方法简单,但因其存在一定偏差,对敏感性与已知菌株不同者需用其他方法重新鉴定。(2)采用分子生物学方法检测:核酸分子杂交技术,运用从MRSA菌株中克隆出来的抗药基因作为探针进行分析,能够比传统方法更快速准确地得到结果。(3)质粒的限制性内切酶图谱方法(restrictionenzymefragmentpatternanalysis,REFPA):这种方法可以比较不同种类的菌株,但由于质粒的不稳定性,有时会丢失或获得某些片段而使结果不可靠。(4)染色体DNA限制性内切酶指纹分析的限制性片段长度多态性方法(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP):该方法将染色体DNA纯化后用酶消化水解,再用凝胶电泳方法分析其碎片。而对大分子量的DNA片段的分离采用脉冲电场凝胶电泳方法(pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE)。PFGE是近年来发展起来的一个比较理想的感染流行检测手段,它可以检测整个染色体上所有酶切位点的变化,是目前公认的细菌分型的“金标准”,需昂贵的仪器和内切酶,操作较繁琐,所需时间较长。(5)PCR方法:通过直接检测细菌染色体上的mec5基因来确定被检细菌是否为耐甲氧西林菌株,不受药敏实验条件的制约,并且编码PBP2a的mec基因只存在于MRSA中,因而特异性很高。4流行因素[4]MRSA可通过接触进行传播,即易感人群从携带者或感染者接触获得MRSA,这是主要的传播方式,另外,MRSA也通过耐药基因转移进行扩展,即敏感金黄色葡萄球菌可从MRSA或耐药肠球菌获得耐药基因,成为耐药菌株。环境是一个很好的传染源,耐药基因可通过灰尘等进行传播,实验已证实了这种扩展方式存在的可能性。年老体弱及免疫力低下者,如糖尿病、肿瘤患者和艾滋病患者,病情危重者,接受侵入性检查治疗的气管切开患者,长期住院的以及接受过抗生素治疗的患者均是MRSA的易感人群。5MRSA的药物治疗5.1常用治疗药物5.1.1万古霉素(Vancomycin)糖肽类抗生素,为MRSA感染的首选药物,主要发挥时间依赖性杀菌作用。5.1.2替考拉宁是用于治疗MRSA感染的另一类粘肽类抗生素,在欧洲被广泛用于治疗革兰阳性细菌感染,该药与万古霉素相比有一些潜在优势,可肌肉注射,半衰期长,对耐万古霉素的细菌有抑菌作用。5.1.3利奈唑烷(Linezolid)属恶唑烷酮类抗菌药物,与其他抗菌药物无交叉耐药性。有报道MRSA引起的院内获得性肺炎病人,用利奈唑烷治疗的生存率和临床治愈率显著高于用万古霉素治疗者。5.1.4阿贝卡星(arbekacin)属氨基糖甙类抗菌药物,是对MRSA感染活性最强的氨基糖甙类抗菌药物。5.1.5复方磺胺甲噁唑(SMZco)对MRSA敏感率为96.15%,但由于SMZco为口服,起效慢,仅适于中度MRSA感染。5.1.62%莫匹罗星(百多邦)涂抹鼻腔连续5d可以有效消毒MRSA的鼻腔定植。5.1.7利福平可干扰MRSA的RNA聚合酶的合成,对哺乳类RNA聚合酶没有影响,需与别的抗生素联合应用治疗MRSA感染。5.1.8新药TOC-39是非口服的广谱头孢类杀菌剂,MRSA感染的最小抑菌浓度(MIC)为3.13mg/L。新药Q-35是在氯喹酮上甲氧基而得的一个新喹诺酮类药物,这两者经证实对MRSA有抑制作用。在四环素类抗生素的9位引入甘氨酰胺基得到的甘氨酸类替加环素6(tigecycline,叔丁基甘氨酸氨基米诺环素,GRA-936)在低浓度下,即可抑制四环素的高浓度耐药,现已在美国上市。5.1.9开发新的抗生素包括β-内酰胺类,其中有头孢菌素(BMS-247243、BAL9141、RWJ-54428、S-3578、NB2001)、新碳青霉烯类(Cs-023、