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第十九章现代药物分析技术目录1手性高效液相色谱法2毛细管电色谱法3超高效液相色谱法4质谱及其联用技术33第一节手性高效液相色谱法对映体(enantiomer):在空间上不能重叠,互为镜像关系的立体异构体。立体异构体指分子中的结构基团在空间三维排列不同的化合物。44手性高效液相色谱法手性药物(chiraldrug):含有手性中心的药物。手性中心即为化合物中某个碳原子上连接4个互不相同的基团时,称该碳原子被称为手性中心。55手性药物临床使用-沙利度胺66手性药物拆分方法与机制拆分基础:创造手性环境和构造非对映异构体。拆分原理:基于把对映体的混合物转变成非对映异构体,再利用它们在物理化学或化学性质上的差异使之分开。对映体分离方法包括:非色谱法和色谱法。77非色谱法和色谱法传统的拆分方法为非色谱法:如分步结晶法,具有很大的局限性,操作过程繁复、耗时,难于进行微量分离和测定。大多采用色谱法:包括TLC、GC、HPLC、CE和超临界流体色谱法等,在分离和检测光学对映体纯度的方面已成为一种重要的手性拆分手段。88手性HPLC法引入“手性识别试剂”或者“手性环境”(手性固定相、手性流动相添加剂)至色谱系统中。手性流动相添加法(CMP)直接法手性固定相法(CSP)99手性HPLC法间接法:又称柱前衍生化法(CDR)药物对映体在分离前先与具有高光学纯度的手性衍生化试剂(chiralderivatizationreagent,CDR)反应,形成一对非对映异构体,再以常规固定相进行分离。1010手性HPLC法直接法和间接法异同点均以现代色谱分离技术为基础,引入手性环境(不对称中心),使药物对映体间呈现理化性质的差异而实现分离,不同的是间接法是将其引入分子内,而直接发引入分子间。1111手性衍生化试剂法对映异构体与手性试剂反应,产生相应的非对映异构体SE为光学活性试剂,称为“选择器”,SA为手性溶质,称为“选择靶”。SASSERSASSARSERSARSER)()()()()()()(1212手性衍生化试剂法常用的CDR试剂主要有:羧酸衍生物、胺类、异硫氰酸酯和异氰酸酯类、光学活性氨基酸类等。1313手性流动相法不必事先将样品制备成衍生物,只需将手性试剂加入到流动相中,手性添加剂与样品形成各种手性络合物,根据形成的复合物的稳定常数不同而获得分离。常用手性添加剂有:环糊精类手性离子对试剂配基交换型等14141.环糊精类手性添加剂环糊精的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃侧链的包合作用以及环外壳上的羟基与药物对映体发生氢键作用。1515环糊精分类-根据空腔大小适合于分子量小的药物对映体分析α-环状糊精适合于多数对映体的位阻和电子特征β-环糊精适合于较大分子药物的对映体分析γ-环糊精16162.手性离子对色谱法一类分离可解离对映体的离子对色谱法,已成功分离了β-氨基醇类、氨基醇类、胺类等对映体化合物。有机酸或碱能与离子对试剂在流动相中反应生成低极性不解离的“离子对”,但反相离子对色谱很少用于手性药物分离,而正相离子对色谱广泛用于药物对映体的分离。1717基本原理在HPLC流动相中加入光学纯反离子可与流动相中的对映体生成非对映体复合物,离子对复合物之间具有不同的稳定性和分配性质,并可与固定相发生不同的静电,疏水和氢键作用,进而差速迁移得以分离。18183.配基交换型手性添加剂配基交换原理:在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位体交换剂形成二元络合物,药物对映体再与其形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。常用的手性配合试剂:氨基酸及其衍生物如L-苯丙氨酸,L-脯氨酸等配位金属有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+等。1919手性固定相拆分法CSP是通过物理吸附或化学键合法把手性化合物键合到固定相载体上。根据固定相材料,又可分为手性聚合物型、蛋白质类、环糊精类固定相。2020手性聚合物型固定相目前使用量大、适用面较广的一类CSP,纤维素衍生物手性固定相大都属于该类。以β-葡萄糖为结构单元的天然光活性线性高聚物,每个结构单元有一个伯羟基和两个仲羟基,分别位于C6和C2、C3位上。2121蛋白质类固定相具有大量可与样品分子结合的部位,样品分子的保留和选择易受流动相等因素影响,因此具有较高的手性选择性,是HPLC分离中最具有吸引力的手性固定相之一。目前使用较多的蛋白质CSP:以牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HAS)和α1-酸性糖蛋白(AGP)通过氨基酸键合到微粒硅胶上制成,商品名为ChiralAGP、Resolvosol和EnantioPac等。2222环糊精类固定相CD在HPLC中可将其键合到合适的载体上制备CSP,CD空腔内部只有氢原子及糖苷氧原子具有疏水性,空腔端口的羟基使CD外部具有亲水性,每个葡萄糖单元又有5个手性碳原子,因此CD具有手性识别作用。2323三种手性HPLC分离方法的比较2424应用实例艾司洛尔手性衍生化HPLC测定血浆中艾司洛尔及其代谢物对映体色谱柱:AglientZorbaxC18(250mm×4.6mm,5μm)流动相:乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲盐(55:45,用磷酸调pH至4.5)流速:0.75ml/min检测波长:224nm进样量:20μl柱温:室温2525应用实例样品处理和手性衍生化方法:取血样0.5mL内标S-普萘洛尔和6%高氯酸300μl混匀10000r/min4℃离心10min取上清液150μl1.0mol/L氢氧化钠1.5ml磷酸缓冲液(pH7)混匀活化LC-18固相萃取小柱真空抽滤,用水洗涤1次,再次抽滤柱床干燥3ml含1%冰醋酸的乙腈洗涤室温吹干50μlGITC乙腈液和5μL0.5%三乙胺,30℃恒温反应30min,吹干残渣溶解进样2626结果:艾司洛尔及其代谢物对映体的血药浓度存在立体选择性应用实例艾司洛尔及其酸性代谢物对映体的HPLC色谱图A:空白血浆;B:空白血浆中加入艾司洛尔、代谢物和内标色谱峰:1.S-代谢物,2.R-代谢物,3.S-艾司洛尔,4.R-艾司洛尔,5.S-普萘洛尔
本文标题:手性高效液相色谱法
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