极具潜力的昆虫表达平台

VickyQiMarch,2011极具潜力的真核蛋白表达平台极具潜力的真核蛋白表达平台极具潜力的真核蛋白表达平台极具潜力的真核蛋白表达平台——默克默克默克默克Novagen®昆虫表达系统工具进展简介昆虫表达系统工具进展简介昆虫表达系统工具进展简介昆虫表达系统工具进展简介蛋白表达平台蛋白表达平台蛋白表达平台蛋白表达平台原核表达系统原核表达系统原核表达系统原核表达系统昆虫表达系统昆虫表达系统昆虫表达系统昆虫表达系统酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统酵母表达系统真核表达系统真核表达系统真核表达系统真核表达系统昆虫细胞表达系统成为受人关注的首选平台昆虫细胞表达系统成为受人关注的首选平台昆虫细胞表达系统成为受人关注的首选平台昆虫细胞表达系统成为受人关注的首选平台基因组大基因组大基因组大基因组大：：：：外源插入片段可达外源插入片段可达外源插入片段可达外源插入片段可达12121212kbkbkbkb；；；；可构建同时表达多个基因的载体可构建同时表达多个基因的载体可构建同时表达多个基因的载体可构建同时表达多个基因的载体灵活的表达方案灵活的表达方案灵活的表达方案灵活的表达方案：：：：早期或晚期启动子表达效果不同早期或晚期启动子表达效果不同早期或晚期启动子表达效果不同早期或晚期启动子表达效果不同能获得重组蛋白高水平的表达能获得重组蛋白高水平的表达能获得重组蛋白高水平的表达能获得重组蛋白高水平的表达：：：：最高可达到细胞总蛋白的最高可达到细胞总蛋白的最高可达到细胞总蛋白的最高可达到细胞总蛋白的50505050％％％％有较完善的翻译后加工过程有较完善的翻译后加工过程有较完善的翻译后加工过程有较完善的翻译后加工过程：：：：绝大多数产物具有生物活性绝大多数产物具有生物活性绝大多数产物具有生物活性绝大多数产物具有生物活性可用于蛋白晶体研究可用于蛋白晶体研究可用于蛋白晶体研究可用于蛋白晶体研究技术简便技术简便技术简便技术简便、、、、生产成本低生产成本低生产成本低生产成本低、、、、无病原性无病原性无病原性无病原性：：：：遗传学上是安全的遗传学上是安全的遗传学上是安全的遗传学上是安全的，，，，用于医药产品开发用于医药产品开发用于医药产品开发用于医药产品开发苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）AutographacalifornicaNuclearPolyhedrosisVirus杆状病毒感染昆虫细胞杆状病毒感染昆虫细胞杆状病毒感染昆虫细胞杆状病毒感染昆虫细胞杆状病毒启动子杆状病毒启动子杆状病毒启动子杆状病毒启动子极早期极早期极早期极早期/早期启动子早期启动子早期启动子早期启动子：：：：ie,gp64晚期晚期晚期晚期/极晚期启动子极晚期启动子极晚期启动子极晚期启动子：：：：polh，，，，p10传统制备重组杆状病毒的方法传统制备重组杆状病毒的方法传统制备重组杆状病毒的方法传统制备重组杆状病毒的方法PlatecellsCo-transfectPickplaquesPlaquepurifyGeneratehightiterstock3days3days3days3daysrepeat3times实际应用对昆虫表达系统的新要求实际应用对昆虫表达系统的新要求实际应用对昆虫表达系统的新要求实际应用对昆虫表达系统的新要求多系统穿梭方便快速选择最合适的表达系统多系统穿梭方便快速选择最合适的表达系统多系统穿梭方便快速选择最合适的表达系统多系统穿梭方便快速选择最合适的表达系统快速筛选快速筛选快速筛选快速筛选最佳表达载体和宿主细胞及发酵条件的组合平行操作多个样品平行操作多个样品平行操作多个样品平行操作多个样品，以获得最佳的重复性高通量高通量高通量高通量、、、、自动化自动化自动化自动化的方法快速筛选高产可溶表达克隆与下游纯化检测的兼容配合与下游纯化检测的兼容配合与下游纯化检测的兼容配合与下游纯化检测的兼容配合蛋白产量蛋白产量蛋白产量蛋白产量小规模(1-5ml)到更大规模的优化Novagen的的的的3套昆虫表达系统套昆虫表达系统套昆虫表达系统套昆虫表达系统——满足各种课题满足各种课题满足各种课题满足各种课题设计之需设计之需设计之需设计之需InsectDirect™瞬时快速表达系统瞬时快速表达系统瞬时快速表达系统瞬时快速表达系统pIEx™表达载体表达载体表达载体表达载体：：：：采用hr5增强子和极早期ie1启动子瞬时表达pBiEx™表达载体表达载体表达载体表达载体：：：：与pIEx载体具有同样的杆状病毒增强子和启动子，同时还有T7lac大肠杆菌启动子，易于在两种宿主细胞中做表达分析Sf9细胞及专用培养基细胞及专用培养基细胞及专用培养基细胞及专用培养基昆虫专用昆虫专用昆虫专用昆虫专用GeneJuice®转染试剂转染试剂转染试剂转染试剂：：：：高效低毒的Sf9细胞DNA转染的最佳选择昆虫昆虫昆虫昆虫RoboPop™Ni-NTAHis•Bind®纯化试剂盒纯化试剂盒纯化试剂盒纯化试剂盒：：：：用于高通量自动His•Tag®融合蛋白纯化。其中特别设计的PopCulture™蛋白抽提试剂用于从培养基中高效收获表达的目的蛋白，不需要离心操作InsectDirectTM载体载体载体载体pIEx™系列各种昆虫表达载体的特点系列各种昆虫表达载体的特点系列各种昆虫表达载体的特点系列各种昆虫表达载体的特点pIEx表达产量表达产量表达产量表达产量：：：：10ml发酵发酵发酵发酵βgalMAPKGSTMAPKcdc2kinaseGSTcdc2kinase137μg123μg91μg89μg63μg63μgFlucβgalcdc2kinaseMAPK3mg1.6mg1.4mgpIEx表达产量表达产量表达产量表达产量：：：：100ml发酵发酵发酵发酵InsectDirect瞬时表达与杆状病毒表达的比较瞬时表达与杆状病毒表达的比较瞬时表达与杆状病毒表达的比较瞬时表达与杆状病毒表达的比较质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达质粒型表达pIEx和和和和pIB两个系统蛋白表达量比较两个系统蛋白表达量比较两个系统蛋白表达量比较两个系统蛋白表达量比较pBiEx细菌细菌细菌细菌/昆虫细胞双表达载体昆虫细胞双表达载体昆虫细胞双表达载体昆虫细胞双表达载体Tuner™(DE3)cellscarryingtheindicatedplasmidsweregrowninLB,uninducedsamplesweretaken,thenIPTGwasaddedandincubationcontinuedfor3hbeforeinducedsamplesweretaken.M-PerfectProtein™Markers1-pBiEX-1/Fluc,induced2-pBiEX-1/Fluc,uninduced3-pET-28b/Fluc,induced4-pET-28b/Fluc,uninduced5-pBiEX-2(GST),induced6-pBiEX-2(GST),uninduced7-pET-41b(GST),induced8-pET-41b(GST),uninducedpBiEX在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达InsectDirect™LICpIEx载体载体载体载体LIC不依赖连接反应的高效克隆方法不依赖连接反应的高效克隆方法不依赖连接反应的高效克隆方法不依赖连接反应的高效克隆方法2.PCR产物以T4DNA聚合酶及dATP处理50分钟3.退火5分钟，加入EDTA1.用任何DNA聚合酶和特别设计的引物扩增4.转化感受态细胞5.铺板蛋白激酶同源异构体表达实验蛋白激酶同源异构体表达实验蛋白激酶同源异构体表达实验蛋白激酶同源异构体表达实验将多种突变基因克隆到将多种突变基因克隆到将多种突变基因克隆到将多种突变基因克隆到pIEx™-1Ek/LIC载体载体载体载体：：：：1天天天天纯化扩增了的质粒纯化扩增了的质粒纯化扩增了的质粒纯化扩增了的质粒采用昆虫细胞专用采用昆虫细胞专用采用昆虫细胞专用采用昆虫细胞专用GeneJuice™转染试剂将重组质粒转染转染试剂将重组质粒转染转染试剂将重组质粒转染转染试剂将重组质粒转染10mlSf9悬悬悬悬浮培养细胞浮培养细胞浮培养细胞浮培养细胞转染转染转染转染48小时后以昆虫细胞专用小时后以昆虫细胞专用小时后以昆虫细胞专用小时后以昆虫细胞专用PopCulture®抽提试剂裂解细胞抽提试剂裂解细胞抽提试剂裂解细胞抽提试剂裂解细胞：：：：2-3天天天天用用用用Ni-NTAHis•Bind®亲和纯化重组蛋白亲和纯化重组蛋白亲和纯化重组蛋白亲和纯化重组蛋白从从从从500ul样品中取样品中取样品中取样品中取10μμμμl跑跑跑跑10-20%梯度胶分析梯度胶分析梯度胶分析梯度胶分析：：：：1天天天天——共共共共1周周周周重组激酶纯化重组激酶纯化重组激酶纯化重组激酶纯化：：：：10ml培养体系培养体系培养体系培养体系48hr,22mgPK2重组激酶表达重组激酶表达重组激酶表达重组激酶表达：：：：扩大培养体系至扩大培养体系至扩大培养体系至扩大培养体系至1LpIEx与与与与pIE1-neo共转染构建稳定表达细胞系共转染构建稳定表达细胞系共转染构建稳定表达细胞系共转染构建稳定表达细胞系与瞬时表达载体pIE1-neo一起转染昆虫细胞，用G418筛选可以与pIEx，pBiEx或pIEx/Bac等载体配合使用，获得稳定表达细胞系稳定转化的sf9细胞可以连续表达50-100代（约一年）适合表达分泌型的外源蛋白Novagen的的的的3套昆虫表达系统套昆虫表达系统套昆虫表达系统套昆虫表达系统——满足各种课题设计之需满足各种课题设计之需满足各种课题设计之需满足各种课题设计之需三切病毒骨架三切病毒骨架三切病毒骨架三切病毒骨架（（（（切在必需基因切在必需基因切在必需基因切在必需基因ORF1629，，，，lacZ基因上游和基因上游和基因上游和基因上游和polh启动子启动子启动子启动子））））阳性重组率阳性重组率阳性重组率阳性重组率95%，，，，大大减少工作量大大减少工作量大大减少工作量大大减少工作量BacVector-3000DNA已经工程化已经工程化已经工程化已经工程化去除去除去除去除7种种种种非必需基因非必需基因非必需基因非必需基因，，，，包含蛋白酶基因和几丁质酶基包含蛋白酶基因和几丁质酶基包含蛋白酶基因和几丁质酶基包含蛋白酶基因和几丁质酶基因因因因与各种带有外源基因的转移质粒载体同源重与各种带有外源基因的转移质粒载体同源重与各种带有外源基因的转移质粒载体同源重与各种带有外源基因的转移质粒载体同源重组组组组，，，，获得重组病毒获得重组病毒获得重组病毒获得重组病毒：：：：pBAC™,pTriEx,pIEx/Bac试剂盒包括试剂盒包括试剂盒包括试剂盒包括：：：：InsectGeneJuice®昆虫细胞昆虫细胞昆虫细胞昆虫细胞专用专用专用专用转染试剂转染试剂转染试剂转染试剂，，，，BacVector三切病毒三切病毒三切病毒三切病毒DNA，，，，对照转染质粒对照转染质粒对照转染质粒对照转染质粒BacVector“传统传统传统传统”杆状病毒系统杆状病毒系统杆状病毒系统杆状病毒系统BacMagic™：：：：100%阳性克隆的杆状病毒系统阳性克隆的杆状病毒系统阳性克隆的杆状病毒系统阳性克隆的杆状病毒系统
BacMagic™DNA在昆虫细胞中与基因供体质在昆虫细胞中与基因供体质在昆虫细胞中与基因供体质在昆虫细胞中与基因供体质粒同源重组粒同源重组粒同源重组粒同源重组，，，，不需要繁琐耗时的噬斑纯化操作不需要繁琐耗时的噬斑纯化操作不需要繁琐耗时的噬斑纯化操作不需要繁琐耗时的噬斑纯化操作；；；；
源于源于源于源于AcNPV基因组基因组基因组基因组，，，，ORF1629被删除被删除被删除被删除，，，，确保只确保只确保只确保只有重组子能在