图位克隆-李金伟

图位克隆技术原理李金伟2012215423无论头上是怎样的天空，我准备承受任何风暴。内容简要图位克隆技术的基本原理1图位克隆的一般步骤（考研）2图位克隆在植物基因分离中的应用3图位克隆的现状和前景4图位克隆技术的基本原理图位克隆(Map-basedcloning)又称定位克隆(positionalcloning),1986年首先由剑桥大学的Alancoulson提出，是近几年来随着各种植物的分子标记图谱相继建立而发展起来的一种行的基因克隆的一种方法图位克隆技术的基本原理基本原理：功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，再利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库（包括YAC,BAC,TAC或Cosmid等），从而构建基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步（chromosomewalking）逼近目的基因或通过染色体登陆（chromosomelanding）方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经过遗传转化试验证实目的基因功能。图位克隆的一般步骤图位克隆的主要步骤（复旦大学2003细胞生物学考研试题）图位克隆的一般步骤2.12.22.4筛选与目的基因紧密连锁的分子标记目的基因的定位目的基因的筛选和鉴定2.3构建高质量、容易操作的大片段基因组文库图位克隆的一般步骤2.1筛选与目的基因连锁的分子标记筛选与目标基因连锁的分子标记（molecularmarkers）是实现基因图位克隆的关键。实质上，分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，精确的分子标记能够极大地提高图位克隆的效率。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选，包括有：RFLP标记、RAPD标记、AFLP标记、SSLP标记、SSR标记、SNP标记等。其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNPs）图位克隆的一般步骤SSLPsSSLP是基于PCR的分子标记，检测比较直接，只需要通过设计引物便可检测鉴定的SSLP标记最为常用的分子标记SNPsSNPs标记的检测也比较直接，它是不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸通常位于不编码区域，常见的检测SNPs标记的方法主要是剪切扩增多态性序列（CAPS），它是基于PCR的图位克隆的一般步骤图位克隆的分子标记示意图图位克隆的一般步骤2.2目的基因的定位目的基因的定位分为初定位和精细定位图位克隆的一般步骤2.2.1初定位目的基因初定位是利用分子标记在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体的一定区域内。初定位通常使用近等基因系法或群组分离分析法。近等基因系是指只有目标性状基因有差异其他性状基因相同的2个群体，可以通过连续回交的途径获得。群组分离分析法，将分离群体中的研究的目标性状根据其类型分成2组，将每组内一定数量的植株DNA等量混合，形成2个池，这2个池仅在目标性状上有差异。利用分子标记技术寻找2个池的扩增谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因连锁。用所有的分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基因连锁及连锁距离的确定。如果分离群体不易获得，可采取混合样品法图位克隆的一般步骤2.2.2精细定位（最艰难、最耗时的限速步骤）在初步定位的基础上，接下来就要利用高密度的分子标记连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析以便精细定位目的基因。精细定位通常采用的方法是侧翼分子标记或者混合样品作图。图位克隆的一般步骤侧翼分子标记指利用初步定位的目的基因两侧的分子标记，鉴定更大群体的单株来确定与目的基因紧密连锁的分子标记，Dixon等（1995）利用该方法已成功的将番茄的叶霉病基因Cf2精细定位到40kb的区间。侧翼分子标记需要对单个植株进行分析，工作效率低混合样品作图指在准确鉴定目的基因表型（单基因控制的隐性突变）的基础上，把大群体中单株突变体分成若干组，以组为单位提取DNA，形成一个混合的DNA池进行分析，根据所有池中分子标记与目的基因发生的重组数来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近所有分子标记的顺序图位克隆的一般步骤一旦把目的基因定位在某染色体的特定区域后，接下来就要对其进行精细的作图。目前，作图的类型可分为2类，分别是遗传图谱和物理图谱。遗传图谱对图位克隆非常重要，尤其是精细的遗传图谱。增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的基础，可以通过整合已有的遗传图谱，或者是寻找新的分子标记来实现。图位克隆的一般步骤2.3构建高质量、容易操作的大片段基因组文库在基因的图位克隆技术中，高质量的基因组文库的构建也是克隆成功的关键。图位克隆的基因组文库主要有Cos质粒文库和人工染色体文库。Cos质粒是一种含有λ噬菌体的Cos位点的质粒载体，大小在5—7kb左右，可高效的地克隆25—35kb的DNA片段。人工染色体的插入片段最长可达2Mb左右，能够覆盖完整的真核基因，最早发展的人工染色体是YAC。所以当要克隆大片段DNA时，需要YAC作载体。以YAC为载体，可将300—1000kb的DNA片段克隆。因此以YAC为载体可以构建高等植物的完整基因组文库。图位克隆的一般步骤2.4目的基因的筛选和鉴定2.4.1目的基因的筛选筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后，就可以利用该克隆为探针进行染色体步移，逐渐靠近目的基因。图位克隆的一般步骤染色体步移是指利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克隆是“一步克隆”，再利用新获得的探针对文库进行第二次杂交，得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”，如此反复即可取到所需的克隆，获得目的基因。染色体步移的主要局限在于当必须经过一个无法克隆的片段时，步移的过程会被打断;当克隆的一端是重复序列时，步移的方向会发生偏差。为克服这些弊端，Tanksley等（1995）又发展了染色体登陆的方法。图位克隆的一般步骤染色体登陆是找出与目的基因的物理距离小于基因组文库插入片段的平均距离还小的分子标记，通过筛选文库直接获得含有目的基因的克隆，他们利用此方法可很快将土豆的pto基因分离出来。在与目的基因紧密连锁的分子标记及大片段插入基因组文库都具备的情况下，就可以以该分子为探针通过菌落杂交，蓝、白斑挑选的方式筛选基因组文库而获得可能含有目的基因的阳性克隆。在用覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA克隆筛选区域特异的cDNA后，仍需对目的基因编码的cDNA作进一步证实。图位克隆的一般步骤2.4.2目的基因的鉴定我们得到的目的基因所在的小片段克隆有可能含有多个ORF（openreadingframe），从这些ORF中鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个关键环节，常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出侯选基因。图位克隆的一般步骤把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：（1）精细定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；（2）检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；（3）测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；（4）筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；（5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。利用新兴的RNA干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因.图位克隆在植物基因分离中的应用这些年来，图位克隆技术在模式植物玉米等一些重要农作物水稻中得到了广泛的应用，分离出了一大批在农艺生产上有重要应用价值的基因。图位克隆在植物基因分离中的应用3.1图位克隆在技术在玉米基因分离中应用3.1.1一般步骤作图群体的构建多态性遗传标记的筛选、开发与利用目的基因的初定位目的基因的精细定位候选基因的获得图位克隆在植物基因分离中的应用一般步骤1.图位克隆的遗传定位原理示意图2.基于SNP位点的CAPS和dCAPS标记开发原理(Lukowitzetal.,2000)3.SNAP标记开发原理(Drenkardetal.,2000)4.通过测序峰图判定基因型示意图图位克隆在植物基因分离中的应用图位克隆过程示意图注:A:玉米10条染色体大小示意图;B:初定位将目的基因定位在某条染色体短臂上;C:在初定位区间内增加多态性标记,进一步将目的基因缩小在M14和M15两个SSR标记内;D:扩大群体并同时增加标记,完成目的基因的精细定位;E:以B73基因组序列为参考预测定位区间内可能存在的候选基因;F:对突变体和突变背景的候选基因序列进行比较,找到突变基因图位克隆在植物基因分离中的应用3.1.2展望玉米不同自交系基因组的重测序、转录组的大量测序、不同自交系间SNP位点的公布以及对基因组结构特点认识的逐渐深入，将会解决目前图位克隆中遇到的技术问题，进一步提高玉米图位克隆的成功率。玉米是重要的粮食作物，也是分子生物学研究的模式植物，且属于异花授粉植物，群体构建较易进行，表型观测显而易见。因此在不久的将来，图位克隆技术必将在玉米中得到更加广泛的应用。图位克隆的现状和前景2.4.3图位克隆的局限性利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，而且还要进行大量的测序工作，所以对基因组大、标记数目不多、重复序列较多的生物采用此法不仅投资大，而且效率低。因而图位克隆法仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和生物上。图位克隆的现状和前景此外，在分析发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状由不止一个的基因位点控制的。例如，在拟南芥Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之间的杂交实验中，我们发现粉状霉菌抗性基因至少涉及三个遗传位点，它们是以附加的方式起作用的。对这些抗性基因中的任何一个作精细定位都要求降低作图群体的遗传复杂性，例如通过创造只有一个位点保持多态性的重组近交系。因此，当影响这些性状的自然或者诱导的突变被定位的时候，如第二位点修饰成分干扰这些分析而使图位克隆此类基因变的非常困难；图位克隆的现状和前景关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。通常这种变化是比较小的，对作图的分辨率也只有较小的影响（Copenhaver等，1998），但如果要定位的基因位于重组被严格限制的着丝粒附近，精细定位的努力就有可能无效，且对常染色体序列1%重组的遗传距离相当于100~400Kb的物理距离，然而着丝粒区域1%重组的遗传距离相当于1000~2500Kb，在现存的物理图谱中很少有着丝粒区域被覆盖等这一切都使图位克隆的染色体步移变的不可能(GeorgJanderetal,2002)。图位克隆的现状和前景生命科学研究已进入基因组时代。图位克隆是最为通用的基因识别途径,至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高精度遗传图谱、大尺度物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列,为图位克隆的广泛应用铺平了道路。现在,图位克隆已经成为分离基因的常规方法尤其令人鼓舞的是,DNA芯片和微列阵的发明为图位克隆的应用展示了巨大的潜力和光明的前景。DNA芯片或微列阵与SNP和cDNA相结合在基因的定位、筛选和鉴定方面具有无比的优越性,相信能大大提高图位克隆的效率。图位克隆发展的最新动向90年代以来,我国先后组织实施了水稻基因组计划和人类基因组计划。我国科学家紧跟世界新技术的发展,积极开展图位克隆研究,在分离、利用水稻和人类的重要基因方面取得了突破性进展。1995年,中国科学院遗传研究所的宋文源等与美国加州大学戴维斯分校的科学家合作,成功地采用图位克隆方法获得了水稻的白叶枯病抗性基因Xa21。目前我国从队伍建设到基因技术(包括基因克隆)的引进和发展等方面都有相当的基础。考虑到起步较晚和作图、测序的巨大费用,我国的各种动植物基因组研究也只能采取在八五期间就确定先拿基因的策略。至于拿到基因后的不同植物有效转化系统的建立则另当别论了。鉴于各种植物的抗病虫图位克隆发展的最新动向基因和与