CTAB法提取总DNA

CTAB法提取槐树总DNA⑴分别精称1.0g槐树新鲜叶片，去主脉，放入研钵。⑵用液氮将叶片组织研磨成细粉，然后将粉末分装于2mL离心管中。⑶各离心管中加入65℃预热的2×CTAB抽提液1000µl和β-巯基乙醇4µl，混和使之充分湿润，于65℃水浴锅中温育1.5h，不时混匀。⑷12000rpm离心10min，将上清液转移至新的离心管中，弃沉淀。⑸上清液中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25：24：1）（v/v），抽提上清，颠倒混匀7min，12000rmp离心10min。⑹将离心后所得的上清液体转移至新离心管；每管加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）（v/v），再次抽提上清液，12000rpm离心10min，上层液体转移至新管。⑺每管加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH8.0)和等体积的异丙醇，轻轻翻转混匀，置-20℃冰箱中冰浴30min~1h，沉淀DNA。⑻12000rpm离心10min，弃上清。⑼用70％酒精和无水乙醇各洗涤沉淀一次，分别离心2min自然干燥。⑽加50µlTE缓冲液溶解DNA；保存于-20℃的冰箱中备用。⑾DNA浓度及质量检测：取3μLDNA提取液，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、质量。琼脂糖凝胶电泳①制备凝胶（1％或1.5％琼脂糖凝胶），将1×TAE电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中经高温融化，混匀，冷却至55℃，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。②待胶凝固后，从制胶平台上拔出梳子，放入加有足够1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面1mm。③用适量加样缓冲液制备DNA样品，然后用微量移液器将样品加入样品孔中。一定要包括合适的DNA分子量标准物。④接通电源，进行电泳使DNA向阳极移动。⑤当加样缓冲液中的溴酚篮迁移至足够分离DNA片段的距离时（即：溴酚篮迁移至距凝胶底部约1cm），关闭电泳。⑥将电泳完的凝胶放入含有溴化乙锭的溶液中染色15~20min。⑦染色完的凝胶可以直接放在紫外呈像系统上照相。槐树RAPD反应体系和程序⑴反应体系：25µl/管ddH2O19.05µl10×Buffer2.5µlMgCl2(25mmol/L)1.5µldNTP(10mmol/L)0.5µl随机引物(50µmol/L)0.25µlTaqDNA聚合酶(5U/µl)0.2µl模板DNA1.0µlTotal25.0µl⑵反应程序：预变性94℃5min变性94℃1min退火36℃1min40个循环延伸72℃2min延伸72℃10min药品配制1.2×CTAB抽提液：2％（W/V）CTAB100mmol/LTris·cl，pH8.020mmol/LEDTA，pH8.01.4mol/LNacl2.1mol/LTris·cl，pH8.0称取一定量的Tris溶于水中，用盐酸（Hcl）调pH值至8.0，定容。3.0.5mol/LEDTA，pH8.0称取一定量的EDTA-Na2溶于水中，用NaOH调pH值至8.0，定容。4.3mol/LNaAc(pH5.2)：称取一定量的NaAc溶于水中，用冰醋酸（乙酸）调pH值至5.2，定容。5.酚:氯仿:异戊醇（25：24：1），氯仿/异戊醇（24：1）：6.TE缓冲液：10mmol/LTris·cl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.07.TAE电泳缓冲液（50×贮存液，pH约8.0）：242gTris碱57.1mL冰醋酸37.2gNa2EDTA·2H20加H20至1L（使用时稀释到1×工作液）8.异丙醇，70％酒精，无水乙醇。