OCTET相互作用系统理论与实验设计培训

BetterLives.BetterPlanet.SMThispresentationistheConfidentialworkproductofPallCorporationandnoportionofthispresentationmaybecopied,published,performed,orredistributedwithouttheexpresswrittenauthorityofaPallcorporateofficer©2014PallCorporationOCTET相互作用系统理论与实验设计培训培训人:陈涛应用经理2Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析再生条件的摸索定量分析3Octet平台组成4FiberopticrodReferencelayerForteBio传感器的基本构造固化方式与固化（检测）物质的不同，创造出了不同传感器。5当一束可见光从光谱仪射出后，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱。任何由于分子结合而形成的膜层厚度变化，能够通过干涉光谱的位移值而体现。生物膜干涉技术（Bio-LayerInterferometry，BLI）6BiolayerInterferometry(BLI)ApplicationofwhitelightinterferometryinmonitoringmolecularinteractionsWhitelightConstructiveinterferencePartiallyconstructiveinterferenceDestructiveinterferenceInternalReference(reflectionsurface1)InterfacewithLiquid(reflectionsurface2)RelativeIntensityWavelength100%07InterferometricPatternChangeswithIncreasedMolecularThicknessRelativeIntensityWavelength100%08干涉光谱位移-时间曲线图可以提供动力学参数Distancebetweenthetworeflectingsurfaces=ℓIntensityλ=ƒ(λ,ℓ)FunctionofdensityandopticalthicknessRelativeIntensityWavelength(nm)100%0nmshiftTime9Octet仪器中内部主要结构10BufferLigand-Biotin(ligand)ProteinofInterest(analyte)Binding(nm)TimeBaselineLoadingBaselineAssociationDissociation•一次检测8个通道•所有数据是实时的•反应的时间，位置，转速，温度，步骤可以自行设定•Baseline,Association和Dissociation三步对于计算动力学参数KD值是必须得。OctetBiosensorsOctet平台动力学检测自动化流程11R=R0+Rte-kd*tR=R0+Req(1-e-kobs*t)A(ligand)+B(analyte)ABkakdKD=kdka1:1binding模型:ka=结合常数，Konkd=解离常数，Koff动力学参数的计算Kobs=Ka*[B]+Kd，表观结合常数Req为一定analyte浓度下的平衡信号，相当于无限长结合时间的最终信号。Rt为解离起始的信号。12简明操作仪器传感器样品程序设定(acquisitionsoftware)测试数据分析（analysissoftware）Warmfor30minHydrate(prewet)foratleast10minPreparesampleplateandwarmittoRT.13有奖问答–下面哪些说法是对的？A生物膜干涉技术的光源是可见光B动力学检测可以获得Kon,Koff,KD;亲和力检测只能获得KDC生物膜干涉技术的信号只和传感器表面的结合分子的厚度相关D主要根据结合曲线的信号来进行浓度定量E如果没有分析物浓度信息，无法获得Kon,Koff,KDF动力学常数和浓度无关14Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析再生条件的摸索定量分析15功能动力学（kinetic）浓度测定（Quantitation）YesorNoAffinity(KD)Kinetic(Koff,Kon,KD)16Octet平台上应用的生物分子范围CellsBacteriaVirusIgMIgAIgG,IgD,IgEAntibodyFragmentsProteinsPeptidesNucleotides(DNA)SmallMoleculesAtoms200nm1000nm0.1nm11,000100,0001,000,00075nm150MWSize7nm1nmBacteriaVirusAntibody-AntigenReceptor-LigandDNA-DNADNA-ProteinAntibodyFragment-AntigenAntigen–FusionProteinAntibody-PeptideMultipleAntibodyPairingsAntibody-SmallMoleculeProtein-SmallMolecule17Octet仪器系统对于科研用户的应用非标记（直接的）、实时在线、快速地对样品进行测定与其他分子相互作用检测方法（双向电泳，FP，Co-IP，WesternBlot，HPLC，ELISA，NMR，ITC，晶体衍射等）互补，BLI技术更快更直接可以fishing蛋白，洗脱后用电镜观察分子结合模式研究，信号传导通路，药物靶点，蛋白晶体筛选，DNAaptamer筛选，蛋白/多肽/分子抑制协同实验，蛋白突变体，膜蛋白受体研究等涉及所有分子相互作用的应用基于相互作用的分子活性研究表达产量的预估18Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析再生条件的摸索定量分析19固化物质的选择有tag（GST，Fc,his,FLAG，biotin）的蛋白优先作为固化物质，但是分析物不得含有相同的tag。如果需要获取KD值，分析物需要清楚分子量和浓度，否则做为固化物质。含有多个结合位点的物质优先作为固化物质实验的简易性，比如A蛋白需要和很多蛋白相互作用，则将A蛋白进行固化不易获取高浓度的物质优化作为固化物质，比如RNA,DNA，多糖等。容易和传感器发生非特异性反应的物质作为固化物质20用于动力学检测的传感器种类固化物质种类固化物质是否需要纯化固化方式Streptavidin(SA)生物素标记物质是biotin-avidinSuperStreptavidin(SSA)生物素标记物质是biotin-avidinAmineReactive(AR)含有氨基物质是化合键Aminopropylsilane(APS)疏水物质是疏水作用，静电作用Anti-hIgGFcCaptureSurface(AHC)人免疫球蛋白（含Fc）否Ag-AbAnti-MIgGFcCapturesurface(AMC)鼠免疫球蛋白（含Fc）否Ag-AbAnti-GSTGSTtag否Ag-AbNTAhisTag否NTA-HisAnti-HumanFab-CH1(FAB)CH1否Ag-Abanti-Flagflag否Ag-Ab直接固化抓取固化每种传感器都有其说明书！21CaptureBasedvsDirectImmobilization抓取固化直接固化ARorStreptavidin传感器•优点:•非常稳定的固化•所有蛋白都可以进行固化•缺点:•需要纯化的蛋白•无序的固化•产生共价键，可能对蛋白活性有影响•再生时需要考察固化蛋白的耐受性AMC，AHC传感器结合抗体Fc•优点:•不会产生共价键，易于保持蛋白活性•可以固化在粗样品的蛋白•固化的有序性•将固化蛋白与分析蛋白一并再生，回到传感器原始状态•缺点:•固化的密度少于前者•固化稳定性弱于前者ONHNH22BiosensorselectionCapturechemicalcouplingabsorbanceAHCAMCAnti-GSTAnti-FLAGNTAproAproGAnti-CH1StreptavidinAR2GAPSSSAbiosensorisbestforsmallmoleculemeasurement.23固化的注意要点蛋白浓度10-30ug/ml蛋白固化稳定：在固化后的baseline必须稳定（0.05nm/min）蛋白固化信号1nm固化到最大信号的80%（结合曲线开始弯曲时）如果测试小分子（分析物），最好使用SSA传感器，蛋白固化信号越大越好固化缓冲液氨基偶联：pH比PI小0.5-1pH，且不得有其他含有氨基的物质APS疏水偶联：不得含有去污剂固化固化后的basline，需要稳定！24特殊物质的固化DNA/RNA的固化：合成时带上生物素，然后用SA传感器固化。多糖：可以利用氨基或者羧基，偶联在AR2G或者APS传感器上，也可以通过生物素化进行固化多肽：合成时带上生物素，然后用SA传感器固化半抗原：APS传感器疏水固化酸性蛋白：APS传感器疏水固化化合物：固化非常困难，一般合成时带上生物素纳米材料：APS传感器疏水固化病毒：APS传感器疏水固化，或者生物素化用SA传感器固化脂质体：APS传感器疏水固化其他多聚物：利用氨基，羧基或者醛基固化在AR2G或者APS传感器上25有奖问答固化的好坏需要考察哪些因素A固化越牢越好B固化物质在固相上的方向一致性要好C易于再生D固化密度越高越好E使用氨基固化的时候，固化物质不得含有其他含有氨基的物质F使用生物素固化的时候，生物素固化试剂与蛋白的摩尔比需要大于326Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析再生条件的摸索定量分析27结合解离注意要点Baseline,association,dissociation的缓冲液（基质）必须一致（非常重要）必要的時候在association的緩沖液中添加BSA和去污剂，盐等以去除非NSB。（0.02%tween20,0.1%BSA,PBSpH7.4），但是固化物质是脂质体时，不得加入去污剂。一般需要对非特异性进行考察，即观察没有ligand的传感器直接与analyte直接作用的信号是否可以忽略结合步骤一定要加入referencewell（0浓度，即只有缓冲液）28预实验•确立每步的大概时间。•观察固化是否成功，是否牢固。•观察分析物是否有结合。•观察是否有非特异性结合。ligandanalyte宽泛的浓度检查非特异性•结合有信号，并且有浓度依赖性•大大高于分析物与传感器本身的信号则说明有特异性结合！29预实验（单浓度实验）Binding(nm)TimeBaselineLoadingBaselineAssociationDissociation5-10min,可以手动调节有曲线出现一定要达到平衡，斜率0.02nm/min，5-10min最高浓度需要有曲线状，5-10min有明显的解离.5-30min.1-2分钟，判断传感器结合曲线是否有异常30如果发现非异性吸附？主要是由于分析物和传感器上基质结合导致。颠倒分析物和固化物更换传感器更换缓冲液，加入更高浓度的去污剂或者盐检查一下分析物中是否含有其他物质Capture传感器SA传感器AR2G传感器APS传