食品中沙门氏菌检验.

食品中沙门氏菌检验一、实验目的1、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。2、掌握食品中沙门氏菌的检验方法。二、实验原理（一）沙门氏菌属简介•1880年E.Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。•沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。沙门氏菌属——生物学特性形态特征：革兰氏阴性，大小为1~3×0.4~0.9μm的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。培养特性：•沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10～42℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH为6.8～7.8。•营养琼脂平板上：35～37℃培养18~24h，其菌落大小一般为2～3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。•血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：绝大多数沙门氏菌有规律的发酵葡萄糖产酸产气，但也有不产气者，不发酵蔗糖和侧金盏花醇、不产生吲哚、不分解尿素。沙门氏菌属——生物学特性沙门氏菌属的抗原•菌体抗原（O抗原）•表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原•鞭毛抗原（H抗原）•纤毛抗原沙门氏菌属——致病性•沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般1～2天或更长。感染剂量为15～20个菌，死亡率达1～4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。•污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。（二）检验1.前增菌-第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2.选择性增菌-在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。3.选择性平板分离-这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。4.生物化学筛选-排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。三、实验仪器和材料1冰箱：0℃～4℃。2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃。3显微镜：10×～100×。4高压灭菌器。5超净工作台。6均质器或灭菌乳钵。7架盘药物天平：0g～500g,精确度0.5g。8灭菌广口瓶：500mL。9灭菌锥形瓶：500mL、250mL。10灭菌吸管：10mL（具0.1mL刻度）。11天菌培养皿：90mm。12灭菌小试管：内径3mm×50mm。13灭菌毛细管。四、培养基和试剂1缓冲蛋白胨水(BP)2氯化镁孔雀绿(MM)增菌液3四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液4亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液5亚硫酸铋琼脂(BS)6DHL琼脂7HE琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.21规定。8TSI琼脂9蛋白胨水、靛基质试剂10尿素琼脂(pH7.2)11氨基酸脱羧酶试验培养基12沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。五、检验样品1鲜猪肉、鲜牛肉；冻猪肉2鲜牛奶、鲜鱼；冻鱼3香肠、虾仁六、沙门氏菌检验流程检样前增菌法直接增菌法冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品25g＋BP225mL25g＋灭菌生理盐水25mL制成检样均质液（36±1）℃一般4h，干蛋品18～24h10mL＋MM(或TTB)100mL10mL＋SC100mL检样均质液的半量＋MM(或TTB)100mL检样均质液的半量＋SC100mL42℃18～24h（36±1）℃18～24h42℃18～24h（36±1）℃18～24hBSDHL(或HE、WS、SS)（36±1）℃40～48h（36±1）℃18～24h挑取可疑菌落TSI（斜面、底层、产气、H2S）、蛋白胨水（靛基质）、尿素（pH7.2）、KCN、赖氨酸H2S＋靛基质－H2S＋靛基质＋H2S－靛基质－非如左述的尿素－KCN－赖氨酸＋尿素－KCN－赖氨酸＋尿素－KCN－赖氨酸＋/－各种反应结果甘露醇、山梨醇ONPG沙门氏菌血清学实验沙门氏菌血清学实验非沙门氏菌非沙门氏菌报告七、操作步骤1、前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取25g（mL），加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃±1℃培养4h(干蛋品培养18h～24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18h～24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃培养18h～24h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃培养18h～24h。2、分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36℃±1℃分别培养18h～24h(DHL、HE、WS、SS)或40h～48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落。沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌）BS琼脂产硫化氢菌落为黑色带有金属光泽，棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变黑色带有金属光泽DHL琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色HE琼脂WS琼脂蓝绿色或蓝色；多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色SS琼脂无色半透明，产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别3、生化试验自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂、蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按生化反应初步鉴定表判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种－＋＋/－＋沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌＋＋＋/－＋沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌－＋＋－沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属－＋－－伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属＋＋＋/－－大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌注：＋阳性；－阴性；＋/－多数阳性，少数阴性肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶判定结果A1＋－－－＋沙门氏菌属A2＋＋－－＋沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌A3＋－＋＋－弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌A4＋＋＋＋－普通变形杆菌B1－－－－－－－－＋－沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B2－－＋＋－－－＋－大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4－＋＋/－＋－摩根氏菌，普罗菲登斯菌属注1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。注2：KCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。注3：＋表示阳性；－表示阴性；＋/－表示多数阳性，少数阴性。沙门氏菌检验——几点注意•冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8℃，18小时内软化。–为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。•进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。–测试中应同时接种阳性对照菌株。