RNA干扰技术与siRNA药物

RNA干扰技术与siRNA药物RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是指内源性或外源性短链RNA诱导同源mRNA降解，导致基因沉默的现象。RNAi被认为是目前国际上最具潜力的一种基因治疗方法。从理论上讲，几乎所有涉及基因异常高表达的人类疾病都有可能设计出相应的siRNA来沉默疾病相关基因，从而达到治疗目的。2001年和2002年，RNAi技术连续两次被《Science》杂志评为当年十大科学成就之一，安德鲁·法尔和克雷格·梅洛两位科学家因在RNA干扰领域的突出贡献获得2006年度诺贝尔生理学或医学奖。RNAi介导的特定基因沉默的有关机制发生在转录后水平，故称为转录后基因沉默(PTGS)。在起始阶段，外源性短双链RNA(dsRNA)进入细胞被一种称为Dicer的酶识别，该酶可将dsRNA切成长度为21~23nt(核苷酸)的小片段RNA，即小干扰RNA(siRNA)。在效应阶段，siRNA结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC在ATP供能的情况下将携带的siRNA解螺旋而激活。激活的RISC通过碱基互补配对与同源mRNA结合，并在距离siRNA5’端10-11bp的位置切割mRNA。断裂的RNA小分子在核酸酶的作用下被降解，从而导致特定基因的沉默。研究发现在哺乳动物中导入dsRNA会引起严重的细胞毒性反应，但利用人工合成的21nt双链siRNA可成功转染体外培养的人胚肾293细胞和Hela细胞。随后，在体外培养的鼠源、灵长类及人源细胞中均证实存在siRNA启动的RNAi效应，并且siRNA可以启动较dsRNA更高效的基因沉默现象；表明siRNA可能是直接启动RNAi的结构单元，目前药物开发也主要是针对siRNA的研究。由于RNAi技术可用于特异性降低或沉默某些致病基因的表达，因此RNAi类药物在人类疾病治疗中的应用前景广阔，发展潜力巨大。RNAi药物研发的一般技术路线是：确定目的基因，设计siRNA序列，获得siRNA产物，siRNA转染，RNAi效果检测。（1）siRNA序列设计siRNA序列设计一般遵循以下原则：①siRNA的长度一般为21~23nt；②由于RNAi的高特异性，siRNA在序列上必须与靶标基因mRNA序列完全一致；③避免选择起始密码子下游50~100nt、终止密码子上游100nt以及5’和3’非编码区(UTR)的序列；④siRNA5’端必须磷酸化，3’端最好悬挂2个dTdT；⑤对siRNA适当的化学修饰可增加其在体内的稳定性。如磷酸骨架修饰、核糖修饰、碱基修饰等。（2）siRNA的给药途径1）局部给药：:目前用于局部给药的有：玻璃体内注射给药治疗眼病；鼻内给药治疗呼吸道合胞病毒(RSV)；瘤内注射针对实体瘤；肌内注射治疗肌肉组织疾病等。局部给药药物可直接作用于靶器官，降低siRNA被核酸酶降解的概率，并可减少siRNA的药物使用剂量。2）全身给药：全身给药主要采用口服、皮内或静脉注射。全身给药可用于治疗全身性疾病，但需要较多的siRNA以使靶器官或靶组织获得有效的药物浓度。同时，siRNA需要有较高的靶向性和稳定性，能有效地被靶细胞吸收而不被破坏。近年研究采用对siRNA进行化学修饰、纳米颗粒包埋等方法有效避免siRNA在体内的降解，促进细胞对siRNA的摄取。同时，使用抗体Fab片段或配体与siRNA结合以及病毒载体等方法可使siRNA特异性地与靶细胞结合，提高其在体内的利用率。全身给药已成为当前siRNA药物主要的给药途径。（3）siRNA安全问题及解决方法1）脱靶效应(off-target)：是指由siRNA通过RNAi机制作用于非靶mRNA导致的非靶基因沉默现象。一般来说RNAi对靶基因的沉默是高度特异性的，但近来研究发现，合成的siRNA分子在哺乳动物体内亦会产生脱靶效应。siRNA可产生两类“脱靶”效应，一类由siRNA进入miRNA通路引起的，siRNA可发挥miRNA功能，通过部分匹配，尤其种子区匹配使许多基因表达量下降，引起脱靶效应，这种脱靶效应会产生细胞毒性。另一类脱靶效应是由于发挥RNAi作用时，siRNA正义链和反义链竞争进入RISC复合物，正义链进入RISC引起非靶基因沉默，导致脱靶效应。实验证明，优化siRNA设计可消除“脱靶”效应，这使得siRNA设计在药物研发中显得非常关键。2）免疫反应：人为引入的siRNA在哺乳动物体内能够激活天然免疫系统，诱导干扰素(IFN-a、IFN-b)和炎性因子(TNF-a、IL-6等)的产生。siRNA通过细胞内吞作用进入内涵体而被TLRs识别，存在于内涵体的TLR-7和TLR-8可识别含有免疫刺激序列模体的单链RNA，存在于细胞膜和内涵体的TLR-3可识别含有免疫刺激序列的dsRNA。此外，大于30bp的dsRNA可直接激活PKR、RIG-I和TLRs进一步激活NF-kB、MAPK、IRF等从而刺激IFN和炎性因子的分泌。IFN通路激活后可引起非特异性的翻译抑制，阻止蛋白合成并诱导细胞凋亡。活化的PKR也可通过使eIF-2a磷酸化而导致普遍的蛋白合成抑制和细胞程序性死亡。此外，在IFN的诱导下，dsRNA可激活2’5’-OAS，从而进一步激活RNA酶L通路，最终引起细胞内mRNA的非特异性降解。不过，通过对siRNA进行化学修饰能逃避机体免疫反应的产生。3）解决方法：化学修饰siRNA可有效避免“脱靶”效应和降低免疫反应。研究发现，反义链5’端2’-O-甲氧化修饰，可避免miRNA同源引起的脱靶效应；锁核酸（LNA）化学修饰siRNA，正义链5’端甲基化，或在正义链3’端插入8个DNA核苷酸，可以避免正义链进入RISC引起的脱靶效应，例如，siRNA双链被2’-O-甲氧基核苷、2-F（氟代）-核苷和DNA修饰后就没有检测到影响干扰素水平和细胞因子，而对应的未修饰siRNA则明显的发生免疫激活反应。另外，被验证刺激免疫系统的siRNA的正义链末端经锁核酸修饰后，可以消除该siRNA的IFN-α免疫刺激活性。（4）siRNA药物的进展以AlnylamPharmaceuticals、TransDerm、PTCTherapeutics、CalandoPharmaceuticals、QuarK、SilenceTherapeutics等公司为代表的一批生物科技公司已经开发了近二十个siRNA药物进入临床试验，其中抗肿瘤药物就有五个，而且采用全身给药。如PTCTherapeutics公司治疗实体肿瘤的RNAi药物PTC299是通过口服给药，作用靶点为肿瘤细胞VEGF，2009年7月进入临床II期试验，预计今年完成此阶段试验。CalandoPharmaceuticals公司的CALAA-01则通过静脉注射给药，siRNA包被在环糊精-人转铁蛋白-AD-PEG纳米颗粒中，防止被核酸酶降解。包被上的人转铁蛋白可以靶向的与膜表面上高表达人转铁蛋白受体的癌细胞结合，并通过细胞内吞作用进入癌细胞，干扰靶基因的核糖核酸还原酶M2亚基，通过降低核糖核酸还原酶M2亚基的表达，达到抑制肿瘤生长和缩小肿瘤体积的作用。还有如ALN-VSP02、TKM08031都是治疗肝癌的RNAi药物，分别靶向驱动蛋白样纺锤体蛋白质(kinesin-likespindleprotein,KSP)和PLK1,均已进入临床试验。鉴于siRNA药物的迅猛发展，众多国际医药巨头也已纷纷投向这一领域。Merck以11亿美元收购了Sirna公司，通过收购方式与Allergan公司合作展开siRNA药物开发。诺华和罗氏分别同Alnylam公司签署了7亿美元和10亿美元的合作协议，包括其专利使用的非独占许可协议。阿斯利康与SilenceTherapeutics公司签署了4亿美元的开发治疗呼吸系统感染RNA药物协议。现在虽然还没有siRNA药物上市，但据研究机构估计5年内将会有第一批siRNA药物上市。从已公开的临床数据来看，siRNA药物具有良好的安全性和有效性，这类药物极有可能成为制药业未来10年的最大亮点。