激光扫描共聚焦显微镜..

激光扫描共聚焦显微技术Laserscanningconfocalmicroscopy•激光扫描共焦显微镜的设计特点:•1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole•2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面•3.具有扫描系统——逐点扫描成像•4.激光作为光源•5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm•电子显微镜的缺点：1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难.2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象•荧光显微镜的缺点:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采集2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作.5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度.6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠激光共聚焦显微镜的应用•单、双、三,四色标记检测。•精确的一、二、三、四维观察。•高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。•静态和动态观察(CA2+,pH,膜电位,膜流动性等)。•定性以及定量分析。•光谱扫描,ROI扫描.•特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。时间分辨和快速扫描动态图像出色的反射光图像明场，DIC,相差和透射光图像单标，双标和三标图像激光共聚焦显微成像技术的应用一.定位、定量•免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化•细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位杂交-fitc+PI•荧光原位杂交：染色体基因定位•单细胞凝胶电泳•GFP的表达•活细胞或活体组织静息游离Ca2+的分布与定量•活细胞内pH的定量、膜电位的测量•活细胞内自由基水平的定量Helagreen-中心体red-纺锤体Immuno-fluorecencelabel二.光学切片和三维重组光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。显微CT与三维重组3Dreconstruction三.动态测量游离Ca2+,Mg2+、K+、Na+测量pH值的检测•自由基的检测•相对测量•程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间•序列的扫描测量F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)PhysiologyChart(Time:11:40:49)0.0040.0080.00120.00160.00Int.200.00400.00600.00800.001000.001200.00sChannel1Channel20.0020.0040.0060.0080.00Int.200.00400.00600.00800.001000.001200.00s四.细胞膜电位的测量标记膜电位探针(慢反应）：JC1510nm530/590nmDioc5(3)548nm573nmDioc6(3)484nm500nm快反应探针：Di-4-ANEPPS496nm703nmDi-4-ANEPPS498nm713nm细胞膜静息膜电位：-70mV线粒体膜电位：-150mV以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针FRAP(Fluorescencerecoveryafterphotobleaching)原理IntenselaserBeamBleachesFluorescenceRecoveryoffluorescence10seconds30secondsZerotimeTime%F五.荧光漂白恢复(FRAP:FluorescenceRecoverafterphotobleaching）荧光光漂白后的回复：FRAP生物膜脂质分子的侧向扩散；胞间通讯的研究；胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。六．荧光能量共振转移(fluorescenceResonanceEnergyTransfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。荧光能量共振转移的条件•两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2•供体与受体的距离在2-7nm•供体的发射波长与受体的激发波长一致荧光共振能量转移（FRET）技术生物大分子结构和功能研究免疫分析核酸杂交分析蛋白质间相互作用研究r:分子间距离R0:分子间发生50%能量转移的距离DAr2R0Dr2R0A检测以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检测到FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。应用：检测大分子的相互作用大分子构象的改变(蛋白)例：大分子(亚基)的结合与分离受体与配体的结合常用荧光探剂：FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP曲霉营养菌丝横隔不同霉菌自发荧光成像，示普通光学显微镜下不曾观察到的现象微生物自发荧光Confocal成像植物学应用:植物细胞中的微管列阵(microtubulearray)周质微管早前期微管带纺锤体成膜体农业的应用:植物细胞中的微丝分布•烟草悬浮培养细胞中的微丝网络农业的应用:花粉萌发过程中微丝骨架的变化农业的应用:Jasplakinolide解聚微丝的实时观察•Zaslavskaiaet.al,MartekBiosciences,MD,June15,2001November2001;Volume128(21):pp4301-4314.Courtesy:Jose-EduardoGomes,UniversityofOregon,USANature,25April2002,pg854•GFP-MAP4融合蛋白表达显示微管骨架（美国Cyr实验室）•奶山羊发育中乳腺上皮细胞主要细胞器的变化•为研究奶山羊乳腺的胚后形态发育，采用活细胞荧光标记法结合激光共聚焦显微技术，观察奶山羊乳腺发育中主要细胞器的变化。•根据奶山羊乳腺发育特点，采样时点分为：妊娠期1月、3月、5月；泌乳期10日、30、60日、120日；退化期3日、7日、21日，共计10个时点。•主要试剂及耗材•DMSO购自Sigma公司；•优质胎牛血清（FBS）、DF12培养基、I型胶原酶均购自Gibco公司；•内质网荧光探针（E-34251，激发/发射波长为504/511nm）、•线粒体荧光探针（M-7512，激发/发射波长为579/599nm）、•Hochest33258均购自Invitrogen公司。•Confocal专用细胞培养皿购自北京博蕾德科技公司。•奶山羊乳腺上皮细胞的分离培养•无菌切取1~3g乳腺组织，胶原酶消化法进行乳腺上皮细胞的分离培养。对胶原酶浓度及消化时间进行优化，确定最适酶浓度为400U/ml，消化时间为3.5小时。以1x106个/ml的密度铺于Confocal专用细胞培养皿中，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，并观察细胞生长情况。2~3天更换培养液，观察细胞生长约80％~90％汇合度时，进行细胞器荧光检测。•乳腺上皮细胞主要细胞器的检测•37℃预热、终浓度为50nmol/L的M-7512工作液，37℃染色40min；•37℃预热、终浓度为1μmol/L的E-34251工作液，37℃染色30min•10μg/ml的Hochest33258复染5min•图像采集与数据处理•激光扫描共聚焦显微镜使用三通道（PMT）检测。•激发谱线：405nm（激发Hochest33258标记的蓝色荧光，染核•488nm（激发E-34251标记的绿色荧光，染内质网）•543nm（激发M-7512标记的红色荧光，染线粒体）。•扫描模式为xyz，以0.4μm的Z轴步距逐层扫描，点平均2次，面平均4次，三个通道序列扫描成像，overlay处理后采图保存。