蛋白纯化流程

走着，看着，身边的故事是否能“联”到你生活里不经意间的感触；听着，学着，那些零碎的知识是否“联”到你科研里正在探索的实验；------知识公园里设计着一位主角，那棵树，笔直的干、侧伸的斜枝是思维的框架，“联着”地下，伸向天空。科研的思维总在不断地规划、设计，梳理知识，以备清晰行动。在设计的流程中不断的吸收新的知识，枝繁叶茂，丰富主干，正如条条大路通罗马，思维也会随之活跃，路也会更加灵活。而今天，我们所要梳理的主干，是蛋白纯化的知识流程，即蛋白纯化的基本策略，愿这些简单的知识点归类能够联到你的科研思维。前奏：释放蛋白，目标：浓缩捕获蛋白；间奏：粗分离蛋白，主要利用离心、沉淀、萃取等方法将蛋白和细胞中的其他成分（DNA、RNA等）物质进行分离。主旋律：精细纯化蛋白，去除蛋白质分子量比较接近的蛋白以及痕量杂质。蛋白纯化流程我们需要根据目标蛋白质的各种性质选择合适的蛋白纯化方法。亲和层析因其高分辨率的特点，常用于精制纯化蛋白，根据目标蛋白与配体之间特异性结合的能力、重组标签蛋白螯合金属离子的能力、带有糖基化修饰蛋白可于外源凝集素结合的能力，亲和层析具有高的目的蛋白分辨率，但是在进行精纯化蛋白之前，需要对蛋白质进行粗纯化，常用的有硫酸铵盐析法。例如分享来自一位网友的纯化蛋白的经验帖子，其目标在于纯化大肠杆菌表达的可溶性sigma32蛋白，该蛋白可以与细胞内的CoreRNApolymeras结合形成复合体，最终确定采用免疫亲和柱来纯化蛋白复合体，但为了提高纯化的效率，首先对复合体进行粗纯化，利用带正电的PEI（聚乙烯亚胺）沉淀酸性蛋白和核酸，接着高盐洗脱蛋白，为了去除洗脱液中的PEI溶剂，采用硫酸铵沉淀蛋白，将蛋白和PEI分开，粗分离纯化后，再采用免疫亲和柱的方法进行精细纯化目标蛋白。凝胶过滤层析可以应用蛋白分子间的分级分离，也可以去除蛋白混合物中分子量差别较大的杂质。例如从Hela细胞中纯化一种叫AP-1的转录因子，就采用凝胶过滤的方法去除混合物中的核酸酶，因为核酸酶能够降解DNA亲和柱，并能够和其他非特异性蛋白结合，影萃取、透析离心细菌破碎动物组织破碎植物材料研磨沉淀法电泳等点聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳离子交换层析疏水层析凝胶过滤层析亲和层析盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀电动、匀浆机破碎超声波破碎酶（纤维素酶、溶菌酶）精纯化蛋白粗分离蛋白蛋白质纯化处理样品层析响目标蛋白的纯化。在分离纯化蛋白时，因为其环境中PH值、有机溶剂、蛋白酶降解等不稳定因素的影响，使得蛋白质分子间的氢键、离子键、二硫键被破坏，影响蛋白的稳定性，而有的蛋白质对其所处的缓冲液要求较高，例如，Stillman实验室纯化大肠杆菌表达的CDC6蛋白，采用GST标签蛋白进行纯化，纯化得到的CDC6不稳定而发生沉淀，后来试验了十几种的buffer，结果发现磷酸钾和谷氨酸钾缓冲液中，CDC6就不会沉淀并具有蛋白活性。由此可见，每一种蛋白往往需要多种纯化方法的精心组合才能达到分离纯化的目的，并且需要仔细考虑试验过程中的环境因素，确保纯化蛋白质的稳定性。在此篇文章中，我想提醒给大家的是：知识的联系和设计，将相关的知识点串起来，同时给自己费心思理解的知识穿上有个性的外衣，这是基于你的习性对于形式中理念的理解，只要用心，我觉得会是一件有意思的事情。另外，结合了一些进行蛋白质纯化实验中的经验，肤浅分析了综合应用各种方法的原则，每一种蛋白质都有其相应的氨基酸的序列，表现出不同的理化性质，这些物理上的差异性可以作为进行蛋白纯化的线索，具体的实验操作还需多次实践验证，愿这些基础知识能为你的实验操作提供理论支持，实验中若有疑惑，可以给我发邮件（[e-mail]），我们公司北京义翘神州生物有专业的蛋白表达纯化团队，多方打听，总能找到一点对您实验有利的线索，若有需要请联系我。