4章蛋白质吸附与生物相容性

第4章蛋白质吸附与生物相容性4.1生物相容性概念与定义4.1.1血液相容性4.1.2组织相容性4.2蛋白质吸附4.2.1蛋白质黏附的重要性4.2.2蛋白质吸附热力学与动力学4.2.3蛋白质吸附研究方法4.2.4蛋白质吸附的Vroman效应4.2.5蛋白质吸附与生物相容性4.3宿主－生物材料的相互作用4.3.1材料反应4.3.2宿主反应4.3.3结构相容性问题4.4.2生长因子在组织修复中的作用4.4免疫细胞与组织修复4.4.1炎症细胞在组织修复中的作用1人体生理环境•生物学环境：处于生物系统中的生物医用材料周围的情况或条件，其中包括体液、有机大分子、酶、自由基、细胞等多种因素。•成人60%为体液，2/3于细胞内，1/3为细胞外液，外液1/5在血管内，4/5在血管外4.1生物相容性概念与定义生理环境特征：¾体温为37℃，由水、电解质、血糖、蛋白质等构成相对稳定的内环境。¾细胞外液的4/5存在于血管外构成组织液，1/5在血管内，即血浆。¾正常人血的相对密度为1.050-1.060，粘度为4-5（通常以水的粘度为1作为标准进行计算）。血浆的渗透压约为313mOsm/L，pH值为7.35-7.45。¾模拟人体生理环境的溶液：有机酸、蛋白质、酯、生物原分子、电解质、溶解氧、氮化合物以及可溶性碳酸盐的NaCl水溶液，浓度约为0.1mol/L，溶液的pH值约为5.5（±0.2）的溶液。生物材料直接与细胞、组织和宿主的生理系统相接触，对生物材料的要求除物理机械性能、化学稳定性、无毒性和易加工成型性以外，还必须具有生物相容性。生物相容性：指材料在特定的实际应用中引起适当的宿主反应和材料反应的能力.材料应用不同场合具有不同的要求和内涵：如与血液接触材料要求具有良好的血液相容haemocompatibility组织工程研究中更强调组织相容性（tissuecompatibility）尤其是细胞相容性（cytocompatibility）生物相容性的核心内涵：针对材料的具体应用场合，材料与宿主间应产生恰当的、相适应的作用。不能根据某种材料在某种场合是生物相容的，就类推到其他所有场合都是生物相容的，而必须与具体的应用相关联。4.1.1血液相容性血液异常情况：z当血管（动脉、静脉或毛细血管）受到损伤，血液离开血管进入组织时，会自动凝血；z当血液与异物表面接触时，可能发生溶血（hemolysis）或凝血（coagulation），从而形成血栓（thrombosis）。z人血浆的等渗溶液为0.9%NaCl溶液，红细胞在低于0.45%NaCl溶液中，因水渗入，红细胞膨胀而破裂，血红蛋白逸出。z溶血性细菌，如某些溶血性链球菌和产气荚膜杆菌可导致败血症z某些蛇毒侵入，含卵磷脂酶，使血浆或红细胞的卵磷脂转变为溶血卵磷脂，使红细胞膜分解z抗原-抗体反应（如输入配血不合的血液）z各种机械性损伤z红细胞内在（膜、酶）缺陷z某些药物等引起。溶血：红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解可由多种理化因素和毒素引起凝血：指血液由流动的液体状态变成不能流动的凝胶状态的过程，是生理性止血的重要环节。实质是血浆中的可溶性纤维蛋白原变成不可溶的纤维蛋白的过程当血液与生物材料表面接触时，各种血浆蛋白质随材料表面性质不同，会不同程度地很快吸附在异物表面，随后引起血小板的黏附。血浆蛋白质的选择吸附，反映了生物材料的血液相容性。为保证血小板不被黏附或活化，而在血管中正常运行，就要求植入的生物材料具有良好的血液相容性。4.1.2组织相容性生物材料:必须满足高纯，无毒，无刺激性，不引起癌症，无诱变性、抗原性，不引起溶血、凝血等，能与组织相容，尽可能不引起病变。降解产物是水溶性小分子，最好是自然产生的代谢物，可通过肾脏和肺排出来，如聚乙醇酸（PGA）的分解产物是CO2和水。生物材料引起宿主的反应:主要是通过宿主细胞对材料表面的识别引起的；如何调控生物材料的表面性能以期达到最佳的宿主反应或细胞－材料相互作用，降低不利的宿主反应是生物材料研究的一个关键问题。4.2蛋白质吸附4.2.1蛋白质黏附的重要性生物材料与生理环境相接触时:9首先到达生物材料表面的是水分子和无机盐离子，其次是体液、血液或培养基中的蛋白质分子，最后才是细胞到达材料表面。9因此在材料表面与细胞之间通常存在吸附的蛋白质层，细胞通过蛋白质层的介导而附着、黏附进而铺展到材料表面9材料表面对细胞的影响或引起的宿主反应实际上是通过影响蛋白质在材料表面的吸附行为来实现的。生物材料表面所吸附蛋白质的种类、吸附速度、吸附量以及空间构象等都直接影响材料的细胞相容性。9血栓形成与溶血，软、硬组织的愈合，感染和无菌性炎症都与蛋白质的吸附有关。材料植入体内发生的一系列反应细胞与材料间的作用是通过吸附的蛋白质来介导完成的蛋白附着粘附铺展蛋白附着粘附铺展从蛋白质靠近材料表面，到在生物材料表面黏附，到从材料表面脱附的每一个过程中都有其独自的特征，蛋白质与材料表面的本征相互作用共同决定蛋白质靠近表面的程度；它们也同时受溶剂分子运动和其本身分子运动性质的影响。在黏附过程中，以下因素构成稳定黏附在表面的驱动力：（1）蛋白质和材料界面间的短程相互作用；（4）由于在蛋白质与表面之间释放结合水以及相反电荷离子而引起的熵值增大；（5）材料表面使蛋白质变性引起的熵值增加。4.2.2蛋白质吸附热力学和动力学在蛋白质从表面的脱附过程中，有三个因素使黏附表面去稳定化并引起脱附：（1）热扰动（2）剪切流动（3）其他能够更稳定地吸附于表面的物质和蛋白质竞争吸附所做的功。图4-3蛋白质在材料表面的吸附和脱附过程示意图蛋白质吸附的特点：9蛋白质的结构及其多样性极大地影响蛋白吸附热力学和机理、吸附的可逆性及多组分吸附的动力学。9蛋白质分子是由多种氨基酸相互缩聚组成的具有三维结构的复杂分子。在不同的空间尺度上，蛋白质有四种不同的结构，即初级结构、次级结构、三级结构和四级结构。其中，四级结构决定了蛋白质与材料表面和细胞的作用。9多数的血液蛋白包含极性、非极性和带电的侧链。在极性溶液体系如PBS或血浆中，为降低体系界面的自由能，亲水的侧链间会相互聚集并趋向存在于与水接触的界面，而疏水侧链则聚集在蛋白质分子的内部。因此在蛋白质分子中产生了截然不同的微区结构，这些微区决定了蛋白质的高次结构蛋白质及其在材料表面吸附后的结构示意图。＋/－表示蛋白质表面的电荷；⊕/\表示溶液中的小分子电荷；阴影部分表示蛋白质中的疏水微区；白色部分表示蛋白质中的亲水微区。1蛋白质吸附热力学蛋白质在材料表面的吸附可以理解为可逆的化学反应P+SPSP代表蛋白，S代表结合位点，PS代表吸附有蛋白质的表面位点。整个吸附系统的吉布斯自由能变化（ΔGads)可以表示为ΔGads=ΔHads-TΔSads(1)式（1）中概括了整个吸附过程的吉布斯自由能变化，包括如下几个部分：1、蛋白质：ΔGProt=ΔHPort-TΔSProt(2)2、吸附表面附近的溶剂（如水和离子）：ΔGSol=ΔHSol-TΔSSol(3)3、生物材料表面：ΔGSurf=ΔHSurf-TΔSSurf(4)由式（5）知，如果反应能使一个或者多个组分的自由能降低，同时使另一组分具有最小的自由能增加趋势，那么从热力学角度说，蛋白质吸附易于进行。式（1）中吉布斯自由能变化为各部分吉布斯自由能变化的总和：ΔGads=ΔGProt+ΔGSol+ΔGSurf（5）2影响蛋白质黏附的因素：9材料表面的拓扑结构9材料表面的亲疏水性9材料表面的电荷9材料表面的化学基团9蛋白的种类和结构性质影响大小大分子具有更多的表面接触位点电荷一般接近等电点的蛋白分子，更容易吸附疏水性一般疏水性强的分子更容易吸附在疏水表面结构稳定性稳定性差的蛋白质（如缺乏分子内交联的蛋白质）可以大范围的运动从而产生更多的表面接触位点解折叠速率蛋白分子快速解折叠利于表面接触位点的形成影响表面相互作用的蛋白质性质性质作用形貌多皱褶表面上与蛋白质相互作用区域多组分化学组成决定分子间力的类型，从而控制材料与蛋白质的相互作用疏水性疏水表面能够结合更多的蛋白质异质性表面特性的非均一性会产生与蛋白质相互作用不同的区域电位表面电位影响溶剂中离子的分布以及和蛋白质的相互作用影响材料与蛋白质相互作用的表面性质4.2.3蛋白质吸附研究方法材料表面吸附的蛋白质数量、组成和构象可用多种分析与测量方法来表征：（1）蛋白数量9放免分析（radia-immunoassay，RIA）9石英微天平（quartzcrystalmicrobalance，QCM）9表面等离子共振（SurfacePlasmonResonance，SPR）9椭圆偏振（ellipsometry）9酶联免疫分析（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）9BCA蛋白定量试剂盒（2）蛋白种类9单向垂直电泳（SDS-PAGE）9双向电泳（2D-PAGE）9质谱（MS）（3）蛋白构象和活性9圆二色谱法（circulardichroism）9全内反射荧光（totalinternalreflectancefluorescence）9红外光谱及衰减全反射光谱（FTIR/ATR）9酶联免疫分析（enzyme-linkedimmunosorbentassay）（4）蛋白吸附的动力学和热力学9石英微天平（quartzcrystalmicrobalance，QCM）9表面等离子共振（SurfacePlasmonResonance，SPR）9等温量热滴定仪（Isothermaltitrationcalorimetry，ITC，TAM)（5）蛋白与材料之间的作用力9扫描力显微术（scanningforcemicroscopy，SFM）9能量转移共振（FluorescenceresonanceenergytransferFRET）4.2.4蛋白质吸附的Vroman效应Vroman效应：血浆体系或多组分蛋白溶液中吸附蛋白的组成是时间依赖的。假说：当t=0时，高浓度的蛋白质优先吸附当t0时，近表面的吸附蛋白的损耗-快速扩散交换当t0时，高亲和力的蛋白逐级交换Vroman效应仅是蛋白沉积与置换结果的一部分。蛋白质按照尺寸与浓度的先后次序吸附于材料表面，然后被浓度较低但和基底材料有更高亲和性的蛋白所取代。4.2.5蛋白质吸附与生物相容性材料－界面蛋白质－细胞－生物系统相互间的信息传递决定了材料的生物相容性。吸附于生物材料表面的蛋白质能否维持其天然的空间构象是决定生物材料是否具有良好生物相容性的重要因素。9当吸附于材料表面的蛋白质能够维持其天然构象或未产生可以引发不良级连反应的构象时，细胞在该材料表面表现出良好的相容性能；9当吸附的蛋白发生变性或产生可以引发不良级连反应的构象时，则细胞在该材料表面表现出差的相容性能生物材料表面、吸附的水层、蛋白质层和细胞间的相互作用正常的蛋白质构象有利于表面黏附的细胞保持正常的细胞功能。在纯水中，水分子相互之间通过氢键可自发形成氢键网络结构这种行为称为水分子的自组合行为9疏水性的材料表面:无法与水分子形成氢键，水分子通过自组合而形成一种较为有序的、疏松的排列结构，这种结构使得疏水性材料表面水的密度要比水本体的密度低一些。9亲水性的表面:可以和水分子形成稳定的氢键，从而与水分子自身之间的氢键形成竞争，因而破坏了水分子的自组合，造成了氢键网络结构的坍塌，水分子在亲水性材料表面采取一种无序的，致密的排列结构，使得亲水性材料表面的水的密度比其本体的密度高9两个疏水性材料表面之间存在着长程（小于100nm）的相互吸引力，又称为疏水作用力（hydrophobicinteraction）；即两个较为疏松有序的水分子聚集结构之间存在着吸引力；9两个亲水性的表面之间却存在着相互排斥的作用力。两个无序致密的水分子聚集结构（水化层）之间存在着排斥力。上述现象的是由水分子在亲疏水性材料表面的不同聚集结构所引起的。前者可以用来解释细胞膜以及蛋白质三维结构的稳定性，后者则可以解释高度亲水性的表面对蛋白质的排斥作用。表面吸附水在(A)亲水性材料表面和(B)疏水性表面的