美国药典-微生物检测

〈61〉非无菌产品的微生物检测：微生物计数检测法生长促进试验和计数方法的适用性概述在供试品存在的情况下，必须确立检测微生物的试验能力。如果引入了可能影响试验结果的在测试性能或产品方面的变更，则必须确认其适用性。供试菌株的制备使用供试菌株的标准化稳定悬浮液或者按照以下所述制备。使用菌种保存技术（种子批系统）以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批不超过五代。按照表1中的描述，分别培养每种细菌和真菌供试菌株。表1.供试微生物的制备和使用微生物供试菌株的制备生长促进供试品存在的情况下计数方法的适用性好养微生物总数酵母菌和霉菌总数好养微生物总数酵母菌和霉菌总数金黄色酿脓葡萄球菌，如：ATCC6538,大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或大豆酪蛋大豆酪蛋白消化物琼脂培养基和大大豆酪蛋白消化物培NCIMB9518,CIP4.83或NBRC13276白消化物肉汤培养基300-350,18-24小时豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100cfu,300-350,≤3天养基/MPN大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100cfu，300-350,≤3天绿脓假单胞菌大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基300-350,18-24小时大豆酪蛋白消化物琼脂培养基和大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100cfu,300-350,≤3天大豆酪蛋白消化物培养基/MPN大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100cfu，300-350,≤3天枯草芽孢杆菌如：ATCC6633,NCIMB8054,CIP52.62,或NBRC3134大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基300-350,18-24小时大豆酪蛋白消化物琼脂培养基和大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100cfu,300-350,≤3天大豆酪蛋白消化物培养基/MPN大豆酪蛋白消化物肉汤培养基≤100cfu，300-350,≤3天白色念珠菌如：ATCC10231,NCPF3179,IP48.72,或NBRC1594沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖肉汤培养基200-250,2-3小时大豆酪蛋白消化物琼脂培养基≤100cfu,300-350,≤3天沙氏葡萄糖肉汤培养基≤100cfu,200-250,≤5天大豆酪蛋白消化物培养基≤100cfu，300-350,≤3天MPN:不适用沙氏葡萄糖琼脂培养基≤100cfu,200-250,≤5天黑曲霉如：ATCC16404,IMI149007,IP48.72或NBRC1594沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基200-250,5-7天或直到实现良好产孢大豆酪蛋白消化物琼脂培养基≤100cfu,300-350,≤5天大豆酪蛋白消化物琼脂培养基≤100cfu,200-250,≤5天大豆酪蛋白消化物培养基≤100cfu，300-350,≤5天MPN:不适用沙氏葡萄糖琼脂培养基≤100cfu,200-250,≤5天用pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲液配制供试悬浮液；为使黑曲霉孢子悬浮，可将0.05%的聚山梨醇酯80加入该缓冲液中。这些悬浮液需在2个小时之内使用，或存放在2o～8o条件下24小时内使用。作为制备并稀释黑曲霉或枯草杆菌营养细胞的新鲜悬浮液的替代方法，可制备稳定的孢子悬浮液，然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。稳定的孢子悬浮液可在2o～8o下保存，保存期经过时间验证。阴性对照为了确认试验的条件，用所选的稀释液替代供试品阴性对照。必须没有微生物的生长。培养基的生长促进对每一批已制备好的培养基和每一批从脱水培养基或根据描述的组分制备出来的培养基进行测试。在部分/整个平皿内的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1中指定的微生物，每种微生物均使用单独一部分/整个平皿培养基。在平皿内的沙氏葡萄糖琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1中指定的微生物，每种均使用一个单独平皿的培养基。按照表１中描述的条件进行培养。对于固体培养基，所获得的生长与标准化接种体的计算值之间的差异因素不大于2。对于刚刚制备好的接种体，发生的微生物生长与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。如果出现了与此前从上一个经过测试并通过的培养基批次获得的微生物生长相当、清晰可见的微生物生长，则液体培养基适用。供试品计数法的适用性样品的制备样品制备方法取决于供试品的物理特征。如果以下描述的规程不能够被令人满意地证实，则必须开发一个适用的替代规程。水溶性产品—溶解或稀释（通常制备1:10的稀释液）供试品，于pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。如有必要，调整pH值为6至8。需要时，用相同的稀释剂作进一步稀释。不溶于水的非脂肪性产品—将供试品（通常制备1:10的稀释液）悬浮于pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。可以加入表面活性剂，如1g/L的聚山梨酯80，以帮助难以与水混合的物质悬浮。如有必要，调整pH值为6至8。需要时，用相同的稀释剂进一步稀释。脂肪性产品—溶解于以过滤除菌的豆蔻酸异丙酯，或者将供试品与所需最少量的、经过加热的无菌聚山梨酯80或另一种非抑菌性的无菌表面活性剂进行混合，如有必要，可加热至不超过40o或者在特殊情况下不超过45o。仔细混匀，如有必要，在水浴锅里中维持该温度。加入充足数量、经过预热的所选择稀释剂，制成原产品的1:10稀释液。仔细混匀，同时维持该温度至形成乳化剂所必需的最短的时间。可以用所选择的含有适当浓度的无菌聚山梨酯80或者另一种非抑菌性的无菌表面活性剂的稀释液，来制备后续的系列10倍稀释液。液体或固体悬浮微粒状—以无菌操作将供试品转移至一个膜过滤设备或无菌容器中做进一步取样。使用每个待检容器中的全部内容物或规定数量的一定剂量。贴剂——去除贴剂的防护面（“释放衬板”）并将它们放置在无菌玻璃或塑料托盘上，将有粘性的一面朝上。用适当的无菌多孔材料（如：无菌纱布）盖住粘性面，以防止贴剂粘在一起，并将10片贴剂转移到所选的含有灭活剂（如：聚山梨醇酯80和/或卵磷脂）的适量稀释剂中。振摇供试品至少30分钟。接种和稀释加入足量的微生物悬浮液到按上述规定制备的样品及对照品（不含检测物）中，以获得一个不多于100cfu的接种体。接种体的悬浮液体积应当不超过被稀释供试品体积的1%。为证明供试品有可接受的微生物回收率，必须使用已制备样品的最低可能稀释倍数来进行检测。如果由于抗菌活性或低溶解度而无法做到这一点时，必须进一步开发合适的规程。如果样品对生长的抑制不能避免，可以在中和、稀释或过滤后加入等量的微生物悬浮液。抗菌活性的中和/去除用制备好的样品按接种和稀释项下的描述稀释，并按供试品微生物的回收率规程培养，将从中回收的微生物数量与从对照品中回收的微生物数量进行比较。如果生长被抑制（以大于2的因素减少），那么修改特定的计数测试规程以确保结果的有效性。规程的修改可以包括，例如：1.稀释剂或培养基体积的增加；2.将某个特定或通用的中和剂加合到稀释剂中；3.膜过滤；或4.综合以上措施中和剂——中和剂可以用于中和抗菌剂（见表2）的活性。最好在灭菌前将它们加入到所选的稀释来论证它们的功效和无毒性。表2.对干扰物质的常用中和剂/方法干扰物质潜在中和试剂/方法戊二醛，汞制剂亚硫酸氢钠酚类，酒精，醛类，山梨酸稀释剂醛类甘氨酸季铵类化合物（QACs），对羟苯甲酸（防腐剂），bisbiguanides卵磷脂QACs，碘，防腐剂聚山梨醇酯汞制剂硫胶质汞制剂，卤素，醛类硫代硫酸盐EDTA(乙二胺四乙酸盐)镁离子或钙离子如果没有找到合适的中和方法，则可以假定未能分离所接种有机体的原因是供试品杀灭微生物活性。这个信息帮助指出此物品不太可能被特定微生物种群污染。然而，有可能供试品只抑制这里所列出微生物中的某些，而并不抑制未包括在供试菌株之中其他微生物或者后者对其不具代表性的那些微生物。然后，用与微生物生长和具体接受标准相适应的最高稀释倍数进行试验。供试品中微生物的回收膜过滤—使用标准孔径不超过0.45µm的膜过滤器。过滤器材质的类型按以下标准选择，即细菌保留效能不被待检测样品的成分所影响。对于所列出的每个微生物，单独使用一个膜过滤器。将按照样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下描述所制备的适当数量的样品（最好相当于1克产品，在cfu数量预计较大时，可减用量）转移至膜过滤器，立即过滤，并用适量的稀释剂冲洗膜过滤器。为确定总好氧微生物计数（TAMC），将滤膜转移至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的表面。为确定总酵母菌和霉菌联合计数（TYMC），将膜转移至沙氏葡萄糖琼脂培养基的表面。按表1中规定培养这些平皿，进行计数。平板计数法—每种培养基至少进行两次平板计数法，并使用计数结果的平均值。倾注平板法—在直径为9cm的平皿中，加入按样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下的描述所制备的样品1mL以及15～20mL大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基加入至平皿，此两种培养基的温度均保持在不超过45o。如果使用较大的平皿，琼脂培养基的量也相应地增加。对于表1中所列出的每一个微生物至少要使用两个平皿。按表1中的指示培养这些平皿。取每培养基计数的算术平均值，计算在最初的接种体中的菌落数（cfu）数量。表面铺展法—对于直径为9cm的平皿，倾入15～20mL、温度约为45o的大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基至每个平皿中，静置凝固。如果使用较大的平皿，琼脂的数量也需相应地增加。干燥平皿，例如，在层流柜或恒温箱里。对于表1中列出的每个微生物，至少使用两个平皿。将已称量好的体积不少于0.1mL、按照样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下的规定所制备的样品，铺展在培养基的表面。按照倾注培养法项下的规定进行培养和计数。最大可能数（MPN）法—MPN法的精密度和准确度低于膜过滤法或平板计数法。所获得的霉菌计数的结果尤其不可靠。由于这些原因，MPN法被保留用于当没有其它可行方法情况下的总好氧微生物计数。如果该方法的使用有据可可循，则按如下进行。按样品的制备，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/移除这些项下的描述，制备一系列至少三个连续、每级稀释10倍的产品稀释液。从每个水平的稀释液中将1克或者1毫升的三等分的试样接种到三管装有9～10毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基的试管中。如有必要，加入表面活性剂，如聚山梨醇酯80或抗菌灭活剂到培养基中。因此，如果制备了三水平的稀释液，则会接种九个试管。在30o～35o温度下培养所有的试管不超过3天。如果由于供试品的性质导致结果的读数很困难或不确定，则在相同温度下，在同样的肉汤培养基或大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中在同样温度下放置1～2天再次培养，并且使用这些结果。从表3确定每克或每毫升供试品中微生物的最大可能数。表3微生物的最大可能数值每套显示生长的试管所观察到的数量组合每克或每毫升供试品的最大可能数95%置信区间每管中供试品克数或毫升数0.10.010.001000＜30-9.400130.1-9.501030.1-100116.11.2-170206.21.2-170309.43.5-351003.60.2-171017.21.2-17102114-351107.41.3-20111114-35120114-35121155-38130165-382009.21.5-35201144-35202205-38210154-38211205-38212279-94220215-40221289-94222359-94230299-94231369-94300235-94301389-1043026416-181310439-1813117517-19931212030-36031316030-3803209318-36032115030-38032221030-40032329090-99033024040-99033146090-19803321100200-4000333＞11