乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书

STANDARDOPERATIONPROCEDUREPAGE1/10乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书（生效日期：****-**-**）乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。2.范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBVDNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。4.原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBVDNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样品的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。5.样品要求5.1适用样品类型：血清或血浆。5.2样品采集：5.2.1血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5mlSTANDARDOPERATIONPROCEDUREPAGE2/10乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书（生效日期：****-**-**）灭菌离心管。5.3样品保存和运送使用专用样品0℃冰壶送检，温度约维持在4℃左右。分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。6.仪器和试剂6.1仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。6.2试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司产品标准批号：YZB/国7265-2013线性范围：100IU/ml-5×108IU/ml最低检出限及定量限：最低检出限浓度为30IU/ml，最低定量浓度为100IU/ml。试剂各组分见表1：表1试剂盒组分表组分名称规格数量核酸提取试剂DNA提取液Ⅰ4.5ml/瓶2质控品及阳性定量参考品阴性质控品250ul/管1HBV强阳性质控品250ul/管1HBV临界阳性质控品250ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×106IU/ml）250ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×105IU/ml）250ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×104IU/ml）250ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×103IU/ml）250ul/管1PCR检测试剂PCR内标溶液100ul/管1HBVPCR反应液270ul/管2Taq酶60ul/管17.操作步骤STANDARDOPERATIONPROCEDUREPAGE3/10乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书（生效日期：****-**-**）7.1试剂准备（试剂储存和准备区）7.1.1进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面。7.1.2取出N个（N=待测样品数+8=待测样品数+4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品+空白孔）PCR反应管，HBV单人份扩增体系配制如下表2：表2反应液配制表组分HBV反应液Taq酶总体积用量/人份27ul3ul30ul将各组分充分混匀，混合好后进行瞬时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将30ul扩增体系分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。7.2DNA提取（标本制备区）7.2.1进入标本制备区，从传递窗中取出PCR反应管，将其放入标本制备区冰箱冷藏。7.2.2从冰箱取出待测样品、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、DNA提取液Ⅰ和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。7.2.3打开金属浴，调节温度为100℃，使仪器自动升温。7.2.4用镊子夹取按需要量准备的1.5ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上，所需离心管数为样品数+8。7.2.5向离心管中各加入450ulDNA提取液Ⅰ和4ul内标溶液，再按编号加入200ul样品，离心管与样品对应编号，每个离心管的编号方向都要朝向管口开启的方向。用振荡器剧烈震荡混匀15s，瞬时离心数秒。7.2.6将离心管放入金属浴，100℃恒温处理10±1min。（摆放离心管时，离心管开口要背向人放置。）7.2.7温育10min后，用镊子从金属浴中取出所有离心管，室温静置冷却。12000g，离心5min，备用。（摆放离心管时要将离心管开口朝向内侧。）7.2.8从标本制备区冰箱冷藏室取出分装好的HBVDNAPCR反应管，向对应编号的PCR管中加入处理好的的样品（包括样品、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品）上清液各20ul，空白对照不加模板，盖紧反应管。8000rpm离心数秒，经传递窗移至扩增检测区。（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀。）7.3PCR扩增（扩增区）7.3.1从传递窗中取出PCR反应管，放入仪器样品槽内。STANDARDOPERATIONPROCEDUREPAGE4/10乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书（生效日期：****-**-**）7.3.2按对应顺序设置空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测样品，并在“samplename”一栏中设置样品名称，探针检测模式设置：ReporterDye1：FAM，QuencherDye1：none；ReporterDye2：VIC，QuencherDye2：none；PassiveReference：Rox。具体设置方法参考《AB7500核酸扩增仪标准作业指导书》。7.3.3打开Run窗口设置循环条件：93℃2min；93℃45s→55℃60s，10个循环；93℃30s→55℃45s，30个循环。7.3.4保存文件，运行仪器。8.结果分析8.1反应结束后，操作人员可根据实际情况自行调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值。Start值可以在3-15，End值可设在5-20。在Log图谱窗口设置的Threshold的Value值，使基线位于扩增曲线指数期，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线，点击Analysis自动获得分析结果在Report界面查看结果，记录样品数值（C）。8.2如果在FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或CT值等于30，在VIC检测通道扩增曲线有对数增长期，则判定样品的HBVDNA浓度小于检测灵敏度。8.3如果在FAM检测通道扩增曲线有对数增长期且CT值小于30，则按以下方法判断：（1）若样品的C﹤100，则样品的HBVDNA浓度﹤100IU/ml；（2）若样品的100﹤C﹤5.0E+008，则样品的HBVDNA浓度＝CIU/ml；（3）若样品的＞5.0E+008，则样品的HBVDNA浓度＞5×108IU/ml；如需要精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后在检测。则该样品的HBVDNA浓度＝（C×稀释倍数）IU/ml。9.质量控制每次实验均需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界阳性质控品。质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判断。9.1试剂盒自带质控（1）阴性质控品：FAM检测通道扩增曲线无明显对数增长期或CT值＝30，VIC检测通道扩增曲线为明显对数增长期；（2）HBV阳性质控品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期且CT值＜30，强阳性质控STANDARDOPERATIONPROCEDUREPAGE5/10乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书（生效日期：****-**-**）品定值范围在2.0×105IU/ml~8.0×106IU/ml，临界阳性质控品定量定值范围在3.0××102IU/ml~1.0×104IU/ml；（3）HBV阳性定量参考品：FAM检测通道扩增曲线有明显对数增长期，呈典型S型曲线，CT值＜29，且R2≥0.98。9.2室内质控每次实验应选择适当的HBVDNA质控品作室内质控，将阳性质控品的数据填入质控图。9.3以上要求（9.1和9.2）需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需从新进行。10.干扰因素10.1临床标本中内源性抑制物：血红蛋白、免疫球蛋白、白细胞内乳铁蛋白、脂类等都可抑制PCR反应，标本应避免溶血、脂血、黄疸等。10.2外源性抑制物：肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套上的滑石粉、标本容器上的抑制物等，标本应按采集要求采集，操作中应小心谨慎，标本容器及实验用具应合格。10.3标本的交叉污染：操作过程中应仔细认真，防止交叉污染，尽量使用带鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取，以及时发现交叉污染。11.生物参考区间：1×102IU/ml~5.0×108IU/ml12.警示/危急值：HBVDNA检测无警示/危急值。13.异常结果处理如遇HBVDAN检测结果与临床诊断或资料，或与近期历史检测结果不相符合，应及时与临床医生联系、沟通，查找原因并采取措施，于《疑问报告发放处理记录表》中记录处理过程。如需复查，需及时保存标本。14.临床意义14.1HBVDNA是乙型肝炎病毒感染的最直接的证据，较其他血清学标志物（如HBsAg、HBeAg）更有价值。14.2HBVDNA测定有助于阻断母婴传播的判断和检测，HBVDNA阳性的产妇，其婴儿随访中60%为HBV感染，而HBVDNA阴性的产妇，其婴儿随访无一例阳性。14.3HBVDNA测定有助于HBsAg阴性的慢性肝炎的诊断和鉴别诊断，在血清学试验HBsAg阴性的人群中，至少有3-4%的HBV携带者，由于HBV的S基因突变，属于HBsAg表达缺陷或低水平STANDARDOPERATIONPROCEDUREPAGE6/10乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书（生效日期：****-**-**）表达而无法常规检出，利用HBVDNA方法的敏感性，可以对HBsAg阴性的慢性肝炎进行检测，还可以区分慢性乙型肝炎和非甲非乙型肝炎。14.4HBVDNA测定可作为抗病毒治疗疗效的判断指标。15.变异的潜在来源标本保存不当或反复冻融，都会影响检测结果的准确。16.注意事项16.1实验过程中必须穿专用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要时戴防护眼罩，接触标本后必须及时更换手套。16.2阳性质控品和检测样品均应视为具有传染性物质，应避免接触到皮肤和粘膜。16.3实验过程必须严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用。16.4样品的处理操作应在生物安全柜内进行。16.5所用检测试剂使用前应完全解冻，瞬时离心后使用，应避免反复冻融。16.6样品核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20℃待用（24h）。16.7操作过程中应防止交叉污染，尽量使用鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取。16.8加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，尽快盖紧管盖。上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。16.9标本制备区所用到的试管、吸头等需打入盛有消毒剂的容器，并与废物一起灭菌后方可丢弃。16.10扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。16.11实验中用过的吸头请直接打入盛有10%巴氏消毒液的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。16.12实验完毕用10%巴氏消毒液或75%酒精处理工作台和移液枪，然后用紫外线灯照射30min。17.记录保存与乙型肝炎病毒核酸定量相关的使用维护保养要如实详细记