辣椒组织培养

1辣椒组织培养姓名：XXX学号：XXXXXXXXXXXXX班级：XXXXXXXXX指导老师:XXX时间:2010年9月13日～11月19日2目录第一章:前言......................................................................................31.1理论起源..................................................................31.2植物组织的培养方法...............................................31.3植物组织培养的优点...............................................31.4目的和要求...............................................................41.5实验原理...................................................................4第二章:材料与方法..........................................................................52.1实验器材和试剂.......................................................52.2培养基的灭菌...........................................................82.3药品及试剂...............................................................72.4实验方法...................................................................7第三章:实验结果.............................................................................103.1辣椒籽的生长..........................................................103.2辣椒愈伤组织的生长..............................................113.3炼苗与移栽..............................................................13第四章:实验结果讨论.....................................................................134.1图片分析..................................................................134.2实验经验总结..........................................................14参考文献...........................................................................................153第一章前言1.1理论起源19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，这一植株能够开花结果证明了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。[1]1.2植物组织的培养方法1、非试管微组织快繁非试管微组织快繁技术是将外植体（一般要求带一叶一芽）放置在室内外普通沙子培养基上进行培养，利用植物腋芽自然倍增达到快速繁殖的目的。一般植物7～15天可以生长出根系。此技术投资低，操作环节少。2、试管组织培养试管组织培养是将外植体（即离体组织、器官或细胞）放置在试管等器皿中在无菌的条件下进行组织培养获得试管苗。1.3植物组织培养的优点：1、占用空间小，不受地区、季节限制。2、培养脱毒作物3、培养周期短4、可用组培中的愈伤组织制取特殊的生化制品5、可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物6、可诱导之分化成需要的器官，如根和芽7、解决有些植物产种子少或无的难题，8、不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征9、投资少，经济效益高410、繁殖方式多，试用品种多1.4目的和要求了解植物组织培养的操作程序；初步掌握植物组织培养的关键技术（培养基配制、灭菌、无菌操作、培养等）。验证何种生长素浓度最适于辣椒愈伤组织的生长。1.5实验原理植物组织培养是指植物的器官、组织或细胞，在人工控制的条件下，接种在人工合成的培养基上，能发育成完整的植株，这就是所谓的植物细胞的全能性——植物的任何一个体细胞，具有完整的细胞核，就具有整套的遗传信息，在一定的条件下能发育成完整植株。全能性的实现是通过脱分化和再分化过程来实现的：分化的细胞分生状态再生植株（外植体）体细胞胚用于培养的器官、组织、细胞通称为外植体，它们的细胞是高度分化的，培养的第一步就是要诱导这些已分化的细胞脱去分化状态（称去分化或脱分化），使其恢复到未分化的分生状态；第二步是要使这些恢复到分生状态的细胞重新分化（再分化）形成植株。第一步称诱导培养，第二步称分化培养。[2]生长激素:6-BA:主要功能：6-BA具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点,因而被广泛采用,并且是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。BA的主要作用是促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生。可用于提高茶叶、烟草的质量及产量；蔬菜、水果的保鲜和无根豆芽的培育，明显提高果品及叶片的品质。[3]NAA:主要功能:适用于谷类作物，增加分蘖，提高成穗率和千粒重；棉花减少蕾铃脱落，增桃增重，提高质量。果树促开花，防落果、催熟增产。瓜果类蔬菜防止落花，形成小籽果实；促进扦插枝条生根等。[4]脱分化再分化器官分化5第二章材料与方法2.1实验器材和试剂实验室一般由三部分组成：预备室、无菌室（接种室）、培养室。预备室进行清洗、培养基的配制和灭菌，外植体初步处理等工作；无菌室是最重要的，要求隔离、干净、无菌，以完成外植体的接种工作；培养室要求光照、温度、湿度能人工控制，以利于外植体的生长、发育，此外，还需注意的是，植物组织培养室不要与微生物实验室混用，那样会增加交叉污染。器材：并无特殊的，高压灭菌锅、超净工作台等，与微生物实验室相同，其他如天平、冰箱、玻璃器皿等与化学实验室相近。药品：用于配制培养基的试剂，要用AR级，以减少杂质对培养物的不利影响。[5]2.1.1培养基的配方培养基是组织培养能否成功的关键，随着研究工作的进展，培养基的种类越来越多，但其组成主要有以下部分：MS培养基及其贮备液（mg/L）培养基贮备液NH4NO3165033000KNO31900Ⅰ38000CaCl2.2H2O44020×8800MgSO4.7H2O3707400KH2PO41703400KI0.83166H3BO36.2Ⅱ1240MnSO4.4H2O22.3200×4460ZnSO4.7H2O8.61720Na2MoO4.2H2O0.2550CuSO4.5H2O0.0255CoCl2.6H2O0.0255FeSO4.7H2O27.8Ⅲ5560Na2.EDTA.2H2O37.3200×74606肌醇10020000烟酸0.5Ⅳ100盐酸吡哆醇0.5200×100盐酸硫胺素0.120甘氨酸2400★把FeSO4.7H2O和Na2.EDTA.2H2O分别置于450ml水中，加热、溶解，然后将2种溶液混合，调pH5.5，再加水到1L用力振荡1～2分钟，避光保存。2.1.2培养基的配制1.母液配制可以按培养基的配方，称取各种试剂、逐一溶解，但这种方法比较麻烦，且有的用量很少、难准确称取。一般地都是按一定比例配制成母液贮存起来，用时按比例稀释，以MS基本培养基为例，配制4种母液：配制母液时要注意：称量准确，按顺序逐一溶解、容量并定容，低温保存。称量准确和定容是保证培养基中各元素的量的准确，因为母液是20～200×浓缩的，这一步不准确，后面的误差就越来越大；按顺序逐一溶解主要是使钙离子、锰离子与硫酸根和磷酸根离子错开，以免发生沉淀。激素一般配制成0.5～1.0mg/mL的贮备液，生长素类先用95％酒精或0.1mol/L的NaOH溶解；细胞分裂素先用0.5～1.0mg/L的HCl或稀NaOH溶解，然后加水定容。2.培养基配制步骤配制含琼脂0.7％、糖3％的MS培养基200mL:称取琼脂1.4g，蔗糖6g500mL大烧杯中加150mL左右的水，加入琼脂，加热溶化，再加糖加入贮备液Ⅰ10mL，Ⅱ1ml，Ⅲ1ml，Ⅳ1ml加水到200mL，用HCl或NaOH调pH7趁热分装到试管中，封口灭菌注意：动作要快，在定容是琼脂可能会出现凝固现象需要在之前准备好的灭菌材料：滤纸、培养皿、纯水、手术刀、镊子、培养基、枪头。2.2培养基的灭菌（1）打开灭菌锅盖，向锅内加水。（2）加水后，将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多，以免影响灭菌效果。物品不要靠近锅壁，以免冷凝水顺壁流入物品中。（3）加盖旋紧螺旋。（4）打开放汽阀，加热，自开始产生蒸汽后5min，再关紧放汽阀，此时锅内的冷空气已由排气孔排尽，让温度随蒸汽压力的增高而上升，上升到压力表读数为1.1kgf·cm-2或0.1MPa，121℃时，保持15min左右即可。2.3药品及试剂琼脂、蔗糖、蒸馏水、四种贮备液、次氯酸钠溶液、NAA、6-BA2.4实验方法2.4.1植物组织培养(一):诱导培养1.培养基的制备.(1)制备:MS培养基含有较高的硝态氮和铵态氮,适合于多种培养物的生长.首先,将MS培养基配制成4种母液,低温保存.(2)制备:配置200mLMS培养基需加入0.7%琼脂,3%蔗糖,配置步骤为:在500mL大烧杯中加入约150mL左右的水,加入琼脂,加热融化,再加蔗糖,加热至彻底融化后,分别加入储备液Ⅰ10mL,储备液Ⅱ1mL,储备液Ⅲ1mL,储备液Ⅳ1mL。然后加水至200mL，用HCl或NaOH调制pH至5.8，趁热分装到15只平底试管中,封口,准备灭菌。2.灭菌.(1)打开灭菌锅,向锅内加水。8(2)将待灭菌物品放入锅内,不要放得过多,物品不要靠近锅壁。(3)加盖旋紧螺旋。(4)打开放气阀,加热,自开始产生真气后5min,再关紧放气阀,此时锅内的冷空气已由排气孔排尽,让温度随蒸汽压力的增高而上升,上升到压力表读数为1.1kg·f·cm-2,121℃时,保持15min左右即可。3.辣椒籽培养.将已灭菌好的物品及经过多次清洗的辣椒籽放入无菌操作室,准备。(操作前注意关掉紫外灯,用酒精棉球擦手。)(1)准备四个平皿,其中三个平皿装上蒸馏水,一个平皿放滤纸。(2)辣椒籽泡于次氯酸钠溶液中10min,拿起分别用蒸馏水漂上三次,然后用滤纸擦干。(3)(在酒精灯旁操作)将灭菌好的辣椒籽放入培养基,一个培养基里放四个辣椒籽。(4)将十五个试管每三只包扎好,做上标记,放入培养箱。(32℃24小时光照)（时间为2010年9月14日至2010年10月11日）2.4.2植物组织培养(二):分化培养植物组织培养:将植物器官的一部分切下来,放在适当的人工培养基上进行培养,这些器官或组织就会进行细胞分裂,形成新的组织。这种组织没有发生分化,只是一团薄壁细胞,叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下,愈伤组织便开始分化,产生出植物的各种器官和组织,进而发育成一颗