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注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系,TEL:010-68498287;E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码:CTM042第1页共23页pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体系统原英文技术手册号码:TM042产品A1360,A1380,A3600和A3610的操作指南。所有技术资料均可在网站上得到,请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本I.描述……………………………………………………………………………………..2II.载体图谱………………………………………………………………………………..3III.产品组分……………………………………………………………………………..6IV.采用pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体和2×快速连接缓冲液进行连接……….7A.操作步骤…………………………………………………………………………7V.采用pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的连接反应产物的转化………………...7VI.注意事项…………………………….……………………………………………….8A.PCR产物纯度…………………………………………………………………...8B.平端PCR产物…………………………………………………………………9C.优化插入片段与载体的摩尔比…………………………………………………10D.有插入片段的转化子的筛选……………………………………………………11E.实验对照………………………………………………………………………...11VII.重组质粒DNA的提取…………………………………………………………….…12VIII.pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体单链DNA的制备….…………………………12IX.疑难解答………………………………………………………………………………13X.参考文献………………………………………………………………………………15XI.附录A:载体序列及限制性酶切位点………………………………………………16A.pGEM®-T载体序列………………………………………………………………16B.pGEM®-T载体限制性酶切位点…………………………………………………17C.pGEM®-TEasy载体序列……………………………………………………….18D.pGEM®-TEasy载体限制性酶切位点………………………………………….19XII.附录B:参考资料…………………………………………………………………..21A.缓冲液及溶液配方………………………………………………….…...………21B.相关产品…..……….……………………………………………….…...………22注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系,TEL:010-68498287;E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码:CTM042第2页共23页I.描述pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体系统可用于PCR产物的克隆。这两种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM®-5Zf(+)和pGEM®-TEasy载体,并在3’末端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点3’-T突出端可提高PCR产物的连接效率,因为3’-T突出端可以防止载体的自身环化,并且为热稳定性聚合酶(1,2)产生PCR产物提供一个匹配碱基。如表1总结的,这些聚合酶常常以不依赖模板方式在扩增产物的3’端加上一个脱氧腺苷酸(3,4)。pGEM®-T和pGEM®-TEasy高拷贝数载体包含有T7和SP6RNA聚合酶启动子,其侧翼和多克隆位点区相接,多克隆位点区位于β半乳糖苷酶的α肽编码区内。α肽插入失活允许在指示培养基用颜色直接筛选重组克隆。另外这两个载体的多克隆位点区的限制性酶切位点适用于采用Promega公司Erase-a-Base®系统(产品目录号#E5750)产生一系列巢式缺失体。pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的多克隆位点区含有一些这样的限制性酶切位点,采用这些酶进行单酶切消化即可释放插入片段。如pGEM®-TEasy载体多克隆区的EcoRⅠ、BstZⅠ和NotⅠ酶切位点。而pGEM®-T载体多克隆区只有一种这样的酶切位点BstZⅠ。这两种载体也可选用适当的双酶切消化释放插入片段。pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体含有丝状噬菌体f1复制起始子,可用于制备单链DNA(ssDNA参见第Ⅶ部分)。单链DNA分子对应于图1底部一条链,图一中上图代表pGEM®-T载体,下图代表pGEM®-TEasy载体。pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体系统包含2×快速连接缓冲液,用于连接PCR产物。采用这种缓冲液进行连接,在室温孵育1小时即可完成。延长孵育时间可增加转化克隆菌数目。一般4℃过夜连接可产生最多的转化子。表1.部分热稳定性DNA聚合酶所产生的PCR产物特性的比较。热稳定性DNA聚合酶特性Taq/AmpliTaq®TflTthVent®/(Tli)DeepVent®PfuPwoPCR产物末端3’A3’A3’A95%平端95%平端平端平端5’-3’外切酶活力有有有无无无无3’-5’外切酶活力无无无有有有有注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系,TEL:010-68498287;E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码:CTM042第3页共23页II.载体图谱A.pGEM®-T载体和pGEM®-TEasy载体多克隆位点序列pGEM®-T载体图1.pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的启动子及多克隆位点区序列。上部序列链对应于用T7RNA聚合酶合成的RNA序列,底部序列链对应于用SP6RNA聚合酶合成的RNA序列。注意:用BstZI(Cat.#R6881)单酶切可释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。注意:用BstZI(Cat.#R6881),EcoRI(Cat.#R6o11)或NotI(Cat.#R6431)进行单酶切可释放插入pGEM®-TEasy载体的DNA片段。注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系,TEL:010-68498287;E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码:CTM042第4页共23页可使用SP6PromoterPrimer(Cat.#Q5011),T7PromoterPrimer(Cat.#Q5021),pUC/M13ForwardPrimer(Cat.#Q5601),或pUC/M13ReversePrimer(Cat.#Q5421)对插入的DNA片段进行测序。注意:用BstZI(Cat.#R6881)单酶切可释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。双酶切也可用于释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。B.pGEM®-T载体图和相关序列位点图2.pGEM®-T载体环形图谱及相关的序列位点pGEM®-T载体相关的序列位点T7RNA聚合酶转录起始位点1多克隆位点区10-113SP6RNA聚合酶启动子(-17至+3)124-143SP6RNA聚合酶转录起始位点126pUC/M13反向测序引物结合位点161-177lacZ起始密码子165lac操纵子185-201β内酰胺酶编码区1322-2182噬菌体f1区2365-2820lac操作子序列2821-2981,151-380pUC/M13正向测序引物结合位点2941-2957T7RNA聚合酶启动子(-17至+3)2984-3注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系,TEL:010-68498287;E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码:CTM042第5页共23页C.pGEM®-TEasy载体图和相关序列位点图3.pGEM®-TEasy载体环形图谱及相关的序列位点pGEM®-TEasy载体相关的序列位点T7RNA聚合酶转录起始位点1多克隆位点区10-128SP6RNA聚合酶启动子(-17至+3)139-158SP6RNA聚合酶转录起始位点141pUC/M13反向测序引物结合位点176-197lacZ起始密码子180lac操纵子200-216β内酰胺酶编码区1337-2197噬菌体f1区2380-2835lac操作子序列2836-2996,166-395pUC/M13正向测序引物结合位点2956-2972T7RNA聚合酶启动子(-17至+3)2999-3pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的特殊应用1.PCR产物的克隆。2.采用Erase-a-Base®系统构建不定向巢式缺失体。3.单链DNA制备。4.重组子的蓝白斑筛选。5.利用双向启动子进行体外转录。(操作步骤详见Promega公司Riboprobe®体外转录技术手册#TM016)。可使用SP6PromoterPrimer(Cat.#Q5011),T7PromoterPrimer(Cat.#Q5021),pUC/M13ForwardPrimer(Cat.#Q5601),或pUC/M13ReversePrimer(Cat.#Q5421)对插入的DNA片段进行测序。注意:用BstZI(Cat.#R6881)单酶切可释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。双酶切也可用于释放插入pGEM®-T载体的DNA片段。注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系,TEL:010-68498287;E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码:CTM042第6页共23页III.产品组成产品包装目录号pGEM®-T载体系统Ⅰ20个反应A3600包括:1.2µgpGEM®-T载体(50ng/µl)12µl插入DNA对照(4ng/µl)100UT4DNA连接酶200µlT4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液1操作手册产品包装目录号pGEM®-T载体系统Ⅱ20个反应A3610包括:1.2µgpGEM®-T载体(50ng/µl)12µl插入DNA对照(4ng/µl)100UT4DNA连接酶200µlT4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液1.2mlJM109高效率感受态细胞(6×200µl)1操作手册产品包装目录号pGEM®-TEasy载体系统Ⅰ20个反应A1360包括:1.2µgpGEM®-TEasy载体(50ng/µl)12µl插入DNA对照(4ng/µl)100UT4DNA连接酶200µlT4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液1操作手册产品包装目录号pGEM®-TEasy载体系统Ⅱ20个反应A1380包括:1.2µgpGEM®-TEasy载体(50ng/µl)12µl插入DNA对照(4ng/µl)100UT4DNA连接酶200µlT4DNA连接酶的2×快速连接缓冲液1.2mlJM109高效率感受态细胞(6×200µl)1操作手册贮存条件:产品A1360和A1380中的感受态细胞保存在-70℃。所有其它组份可以保存在-20℃或-70℃。注意:本中文操作手册仅供实验参考,在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系,TEL:010-68498287;E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码:CTM042第7页共23页IV.采用pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体以及2×快速连接缓冲液进行连接反应的步骤1.短暂
本文标题:pGEM-T中文说明书
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