本实验将探究抗肿瘤药物中的顺铂和阿霉素对细胞增殖与凋亡的影响

本实验将探究抗肿瘤药物中的顺铂和阿霉素对细胞增殖与凋亡的影响。1.材料与方法1.1材料1.1.1细胞株人胃癌BGC-823细胞为本实验室常规保存的细胞，于37℃、5％co2培养箱中培养。1.1.2主要试剂顺铂（母液浓度5mg/ml），阿霉素（母液浓度5mg/ml），4℃冷藏。四甲基偶氮唑盐（MTT，母液浓度5mg/ml）液，避光保存。还有DMSO培养液，胰酶，胎牛血清，DMEM培养基，裂解液（0.01MHCI，10%SDS），PBS，PI染液，Hoechests-33342染液。1.1.3主要仪器用具荧光显微镜，CO2培养箱，离心机，酶标测定仪，冰箱，计数器，排枪，96孔板，酒精灯等。1.2方法1.2.1原理概述细胞增殖的检测方法很多，本实验选用的MTT检测法是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法。其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使黄色的外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，生成的甲瓒量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。其优点是简单、快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验，肿瘤放射敏感性实验分析。IC50是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在MTT法中,就是以对照组吸光度OD值减少一半所需的药物浓度为IC50。除此以外,半数抑制浓度的含义还相当于药物对培养细胞的最小致死剂量的平均值,作为反映药效的定量指标,在各种药物的筛选中广泛应用。本实验将以此法测定药物对细胞增殖抑制的IC50值所对应的药物浓度。检测细胞凋亡的方法也有很多。根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。本实验选用的Hoechests-PI双染色法是常用的形态学观察法之一。一般可依细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。利用Hoechests-PI双染色法观察细胞核的变化，其中PI(碘化丙啶)是定量细胞化学的荧光染料,能插入双链DNA和RNA的碱基对之间;每隔5个碱基插入一个PI分子。经RNA酶消化后与DNA特异结合。以特定波长激发,可发射出红色荧光。核酸分子越大，则插入的PI分子越多，荧光强度越大。Hoechests是非嵌入式的特异结合DNA的活性染料，主要结合于DNA的AT碱基对，可进入活细胞。用于细胞周期的研究、染色体和细胞核的观察，紫外激发可以发出明亮的蓝色荧光。1.2.2MTT法观测药物对细胞增殖影响接种细胞：取对数生长期的BGC-823细胞，用胰酶消化计后用培养液配制成细胞悬液（浓度约4×104/mL），取细胞接种到96孔板中，每孔200μL（即8000细胞/孔）。其中A1只加培养基。于37℃、5％co2培养箱中培养；加药处理：用DMSO稀释顺铂，用水稀释阿霉素，待细胞贴壁后，弃掉培养基换相应浓度的药液处理，培养箱中作用48小时；MTT法测定量效曲线：取测定孔，弃去培养基，加100μL新鲜的培养基，加12μLMTT，在37℃、5％co2培养箱中孵育4小时后，加100μL裂解液。37℃、5％co2培养箱中孵育过夜，用酶标仪测定OD570值。作细胞的量效曲线，计算出半数抑制浓度（IC50）。1.2.3药物试验浓度的确定顺铂和阿霉素均设置1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml5个浓度组，每组设6个复孔，以MTT法测定细胞活力率，并以计算得出的IC50作为细胞核形态观察施药的工作浓度。1.2.4Hoechests-PI双染色法观察细胞核形态的变化取生长到80-90%融汇度，对数生长期的细胞，按1：4比例传代，取1瓶细胞传到4瓶；第二天在确定了药物的半数抑制浓度（IC50）后，设置2个未加药对照，加入与药液等体积的DMSO或双蒸水；设置2个加药实验组分别向瓶中加入相应的浓度接近半数抑制率（IC50）的药物，即终浓度2.36ug/ml的顺铂和终浓度2.04ug/ml的阿霉素。37℃、5％co2培养箱中培养72小时后，收集药物处理的细胞和对照组细胞培养液，用胰酶适度消化细胞，用收集的培液吹打细胞，将分散成单个的细胞悬液收集至10mL离心管中，1000rpm离心15min，去上清，用0.2毫升PBS重悬细胞。取178μLPBS细胞悬液，加入PI染液20μL（终浓度100μg/ml），Ho.33342染液2μL（终浓度10μg/ml），混匀，37度温箱中避光标记15min（带手套操作）。1000rpm离心10min，弃上清，依沉淀量加入10-50μLPBS重悬混匀，取10μL滴于载玻片上，盖片（不能有气泡或漂起），保存于暗处。紫外激发，倒置显微镜下显微观察拍照。2.结果与分析2.1MTT法观测药物对细胞增殖影响2.1.1不同浓度顺铂或阿霉素对BGC-823增殖的抑制作用依实验数据，利用Excel得以下曲线图：图1.利用MTT法测定顺铂浓度对BGC-823细胞增殖影响的实验结果本试验选用的不同浓度顺铂对BGC-823均具有抑制作用，且随着药物浓度的升高，曲线基本呈下降趋势。经计算得：对于顺铂，IC50=1.45μg/ml。图2.利用MTT法测定阿霉素浓度对BGC-823细胞增殖影响的实验结果不同浓度的阿霉素均对BGC-823具有明显抑制作用，且随着药物浓度的升高，细胞活力下降，即抑制率逐渐上升，根据曲线经计算确定阿霉素的半数抑制浓度：IC50=2.53μg/ml。2.1.2顺铂与阿霉素之间的比较药物浓度（ug/ml）对照12468顺铂组(OD值)0.1520.0470.0520.0050.0360.006阿霉素组（OD值）0.1520.0950.0450.0320.0260.028顺铂：IC50=1.45μg/ml；阿霉素：IC50=2.53μg/ml由上对比，总体而言，顺铂对BGC-823细胞的抑制作用高于阿霉素作用。2.2Hoechests-PI双染色法观察细胞核形态的变化2.2.1细胞凋亡核形态观察——顺铂对照组（加入等量DMSO）实验组（实际加入2.4μg/ml顺铂）对比两图，实验组的细胞明显少于未加药的对照组，可见药物确实对BGC-823细胞的增殖具有一定抑制作用。且实验组中一些细胞有干缩现象（实验组中细胞极少，也可能由于操作失当，原因尚未明了）。2.2.2细胞凋亡核形态观察——阿霉素对照组（加入等量蒸馏水）实验组（实际加入2.04μg/ml阿霉素）对比可知，加阿霉素处理的实验组中细胞凋亡数要略多于未加药的对照，说明了阿霉素对BGC-823细胞凋亡有一定程度促进作用。以上四幅图中，蓝色而染色质不凝集的细胞应为正常细胞，蓝色很亮且染色质高度凝集的细胞应为凋亡细胞，橘红色或紫色的细胞应为细胞膜破损的坏死细胞（也可能是由于操作暴力而遭破损的凋亡细胞和正常细胞）。顺铂实验组的细胞数要少于加阿霉素处理的实验组，可能顺铂对BGC-823细胞增殖的抑制作用强于阿霉素，也可能是由于操作失误导致细胞数少。3.讨论3.1MTT法观测药物对细胞增殖影响虽然获得的结果能在一定程度上反应两种药物对BGC-823细胞增殖的抑制作用，与预期结果比较一致。但部分操作失误等导致数据不合理，使本次实验结果的可信度和科学性有所降低，有待商榷。尤其是测定OD值时，较多数据为负值，重复测定几次也仍为负值，作量效曲线时舍去了部分负值数据，这其中很可能有不合理不科学之处。对于出现负值的原因，我们有多种推测，可能是在使用排枪加样时不小心使得细胞接触到了调零孔中，导致调零组细胞数比某些实验组的要多，从而OD呈现负值；加MTT液时需关灯操作，96孔板的孔分布较密，极易眼睛看花而加错孔，这可能是发生操作失误；小组共4名成员，每天轮流换人到实验室操作，操作能力和细心程度有差异，可能会造成一定的实验误差。且在96孔板加药时，由于忘记设置加细胞不加药的对照组（重大错误！），便立即在全部试验孔加了药后，从6和7行吸出药液，换加相应溶剂作为对照，此失误必定对实验结果造成了极大影响。依据OD值计算IC50时，由于数据处理错误（重大错误！），导致根据算得的错误IC50值，在实验组细胞中分别加入了2.4μg/ml的阿霉素和2.04μg/ml阿霉素，与后来改正方法后算得的IC50值（顺铂：IC50=1.45μg/ml；阿霉素：IC50=2.53μg/ml）差异较大，这也可能是顺铂实验组中细胞数少的原因。3.2Hoechests-PI双染色法观察细胞核形态变化荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。Hoechst-33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，因其能与DNA分子结合受激发显蓝光，故常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。因此将两者搭配染色可实现同时对凋亡细胞和活细胞染色。我们组的我们的未加药对照组也出现了凋亡细胞，这可能与我们所用来进行培养的细胞有关。我们有一瓶细胞由于没有及时传代而生长状况不佳，我们换了培养基后继续使用，所以细胞可能过了细胞的对数增长期而进入衰亡期，以至于有自动凋亡的细胞出现。另一方面也解释了为什么我们爬片和流式细胞术的细胞数目很少的原因。周四上午6组的实验结果中，加药0.5ug/ml和1ug/ml处理Hela细胞后，孔中细胞浓度均比对照组中低得多，差异非常显著。加药0.5ug/ml的孔中几乎没有死细胞，活细胞数也是最少的。而加药1ug/ml的孔中坏死细胞数（红色小颗粒数）比对照组和加药0.5ug/ml的孔中均多，活细胞数介于两种之间。说明两种浓度药物对Hela引起细胞凋亡作用较明显，但1ug/ml的作用效果更好，可推测药物作用具有浓度依赖性。但要探究药物浓度与促进细胞凋亡作用的关系，还需进一步设置更多的浓度进行对比探究。但视野中着色并不均匀，这可能是接种细胞时未摇匀所致。细胞分布不均匀对实验结果有非常严重的影响，因拍照时是随机取视野进行拍片，视野图片具有片面性，不能完全反应整体情况。因此建议以后做此类实验时，切记一定不要忘记摇匀。