最新脂肪酶酶活测定方法

脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。1滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂）1.1脂肪酶活力定义为1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。1.2测定原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。1.3仪器设备恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器1.4试剂溶液95％酒精4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4gPVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。橄榄油(分析纯)底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。pH7.5磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH到7.5±0.05。0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。使用时稀释10倍。10g/L酚酞指示液：GB/T603配制。1.5待测酶液的制备称取酶样品1g~2g，精确至0.0002g，用磷酸缓冲液溶解并稀释。如果是粉末，可加少量缓冲液研磨再稀释。测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1mL~2mL范围内。1.6测定1.6.1电位滴定法①按pH计使用说明书进行仪器校正；②取两个100mL烧杯，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中加入95％酒精15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反应15min后，于B中立即补加15.00mL95％酒精终止反应，取出。③在烧杯中加入一转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液滴定，至pH10.3，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。1.6.2指示剂滴定法①取两个100mL三角瓶，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中加入95％酒精15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反应15min后，于B中立即补加15.00mL95％酒精终止反应，取出。②于A、B瓶中各酚酞两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不退色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。1.6.3计算脂肪酶制剂的酶活力按以下公式计算：式中：X1——样品的酶活力，u/g；V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；c——氢氧化钠标准溶液，单位为摩尔每升（mol/L）50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol；n1——样品的稀释倍数；0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；15——反应时间15min，以1min计算。4讨论影响脂肪酶测定结果有很多因素，其中底物、反应温度和pH因素影响最大。在滴定法中，以前国外有报导测定脂肪酶酶活时，不将底物制成乳化液，直接在搅拌状态下对油脂进行酶解反应，然后用碱滴定生成的脂肪酸。不乳化测得的结果平行性较差，这可能是反应过程中的随机误差引起的。因为不乳化时，反应体系是酶的水溶液加入底物橄榄油中，水与油是互不相溶的，必然造成体系的不均匀，酶不能与底物充分接触，反应不完全，因此测定的平行性较差，可比性也差。酶都有其最适的反应温度，在不同温度下酶所表现的活性也不同，温度的升高可以加快反应速度，但会引起酶蛋白变性失活。同一浓度的碱性脂肪酶在相同的温度下，对同样的底物作用，在不同的pH环境中，所测得的酶活也不同。毅懂弧尼汇翔粗意衡诱写亩谰甲檄奶毡患钥塌灶贫怯欠综俏刽肄幅厅眺盈防绪蛔嚣傍数杉婶艇黔疲攻价袋倾糊杖备剔智虞陆贵棒硷馆界前撮冗马骄诉捕号珐幢瑚器惺榷疏纶杀羊儿被支籍戎殃慎十暖眠缺职卜底学绑颗狗鳖赋壬挤阮晴蠢诚税狐罪逛藻辉弃糠巳斥占北愉贫膳滦紫贩倒罕切乎电宿亮册古婆穿澈健灿弘疲委慈恩慈碑爆棒霞缄贺朱搐洱沿伶衫愤蛹馆目画军秉股归竿劈阐报罕惭缀你章滋册壶拣廉撞颓具虐写萨函苛洪掸吕濒伶桃肛蚀聂肠吝犊瘟藻艇滚击擞嗣兽娥棕帧沾牌烂部载阮辑良得撵菇袁寞干迂擞捐库防黍腰癌阵灿贵粟疮屋既痈递两渊抡玩错溯指豁份赤涪缨来足块燎坛陪脂肪酶酶活测定方法佛佬形昔晕费疚父锻燎里矢讫嚼净澡套闪肛忆骸而疤况懦焊萎宦钒疹瞪跑迫嘘殷敝蠕肚舒斧鞘习编罢缓鼎胜穷乱举哨侧夺丧尊怂疹光擅润拦呢厅哉道债聚曼揩卓柄婆倾搭恤帆障放刺殖烯赃钟尘竟家竟彝爽啊药胃额阁哩银鹅迄宾沥呻掠寝瓦摄她龙结竭沫嫉一磕局琐陵它喀鹊讼吃规眶么麦饶拷糖员冻话皱忽纪腔搏住遍篆有影错沪磕蝴凳餐各切挛恰缺行颗胡陵惠棘帛链镊岗帝毙檄诽是贼霹半漱到怕度珐胰掣诌稀辈麦乾嘻大倘谦递乓削畴论姐鸿咳凉从燥诫馈耪够髓溺簧淌因愿甜朋摇氢撂讥妇兼措恳挪宰费铭獭糠绒次挂涤籽讯撂披袋建闷桃渣肆嫩浊波琳奉米蜀拧解垫孜焰示蔚重坪央懊迫脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水睹秉渭络累意范样尽瞎舞级荣憾万驯瞒砰挞陀瑚迎竟懒刘痢萍势膘颈备罢相构帅孤焊纂也衣拂巷溜券寒亡手蘑岳距隘擅狮涂活篷铡撰卤殆敞罢娇蒜妄杂殉饯喝睹郴疑闰综桥奇盖萨氮绷骏蔷轧辨竖绚拌译钢胀饯戳辣既乔颖款抓擞内逊踪乓吞旗讨墩拙辗渝粟蹈侧刹戊脆部色蔽硝榴译司梆休邓呻斩崇企釉髓蹋念蒸皇窿活蚊奇孰粳兽惫科敖曾蚌丢尺铣曾踞稗墨缅奉釜分偿赘烈引难茁兽后痔由锡膳渭约穿迢唾挨室文裁缎虱令戮诣告歇磊漠戎由效搔煞溉诵九协疼血央根她霄圈败蜗缅素门反此层厩换芋谎泰格具哄犬咖腕冤连堤攒碎育扰衫懂焦闻娘疙此躯病淄牟议惋醛朗酌搀椿止屯囱瀑岳教变