EGFR突变检测意义及方法学简介

-1-内容为何要检测EGFR突变EGFR突变类型及意义标本因素对突变检测的影响突变检测流程与方法概述ARMS试剂盒检测EGFR突变非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展-2-具有EGFR基因敏感突变者TKI疗效显著Author#screenedEGFRm+AgentRRTTPInoue19916吉非替尼75%9.7mosPaz-Ares21047127厄罗替尼82%13.3mosOkamato311832吉非替尼75%NDSutani410038吉非替尼78%9.4mosMorikawa512346吉非替尼62%9.7mosSequist69831吉非替尼55%11.4mosMok7437261吉非替尼71%9.6mosMaemondo8228吉非替尼74%10.8mosMitsudomi9172吉非替尼62%9.2mos1JCO2006;2-5ASCO2006;6ASCO20077MokTSetal,NEJM2009;8MaemondoMetal.NEJM20109MitsudomiTetal.LancetOncology201070.4%EGFR基因突变检测在临床应用的意义(1/2)-3-为何要检测EGFR突变(2/2)IPASS:根据突变状态的疗效分析04812162024Timefromrandomisation(months)0.00.20.40.60.81.0ProbabilityofPFSGefitinibEGFRM+(n=132)GefitinibEGFRM-(n=91)Carboplatin/paclitaxelEGFRM+(n=129)Carboplatin/paclitaxelEGFRM-(n=85)GefitinibEGFRM+(n=132)GefitinibEGFRM-(n=91)Carboplatin/paclitaxelEGFRM+(n=129)Carboplatin/paclitaxelEGFRM-(n=85)-4-EGFR基因突变检测概念EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是：EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。EGFR检测检测物质部位方法基因突变DNA细胞核测序法、ARMS法等拷贝数DNA细胞核荧光原位杂交法（FISH）蛋白表达蛋白质细胞膜免疫组化法（IHC）RNA表达RNA细胞核RT-PCRX-5-NatureReview2007,7:169NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类-6-EGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性组别突变类型所占比例对吉非替尼敏感性1Exon19deletions;L858R~90%敏感2T790M/deletions;T790M/L858R;G719X;L861Q;S768I~7%敏感，数据有限3T790Malone;Exon20insertions;othermutations~3%不敏感Moketal.,2008Kimetal.,2008Hirschetal.,2006AZIn-HouseData-Unpublished-7-标本采集及病理评估DNA抽提及质控检测报告EGFR突变检测ARMS测序法其它方法EGFR突变检测流程-8-EGFR突变检测中的相关角色患者临床医生胸外科医师内镜医师收集肺癌组织标本病理科医生准备样本实验操作及结果分析实验室人员报告结果给临床医生-肿瘤科医生-放疗科医生-呼吸科医生-9-标本因素对EGFR突变检测的影响--肿瘤组织特点--遗传异质性对检测方法敏感度有较高要求正常细胞混杂ANNUALBUSINESSREVIEW用于EGFR突变检测的标本•肿瘤组织—目前最可靠的标本；•其它样本：外周血（血浆、血清）细胞学（胸水、痰液细胞学）支气管刮取物仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用-11-标本因素对EGFR突变检测的影响--组织标本种类--对检测方法有相应要求，组织标本及DNA质控尤其重要冰冻新鲜组织固定包埋组织--外科手术标本完整，量多广泛--小活检标本完整，量少受限--外科手术标本片段化，量多受限--小活检标本片段化，量少极度受限DNA质与量适用方法-12-肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本病理学评估组织切片•非小细胞性肺癌诊断及类型•肿瘤细胞比例•肿瘤细胞总数•标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞•H&E染色片用于病理评估•白片用于提取DNA•建议最少切片数：--手术标本，5µmX4--小活检标本，5µmX8•组织标本来源•手术标本•支气管下活检•经皮穿刺活检•标本处理及贮存•新鲜冻存：液氮或-80C•FFPE-13-DNA提取及质控推荐用QIAGEN或类同试剂盒提取DNA紫外分光光度计：适合新鲜组织DNA质控测定总量（OD260）及DNA纯度（OD260/280）qPCR：FFPE来源DNA的最可靠质控方法检测可扩增的DNA片断评估是否存在PCR抑制剂PCR产物长度可扩增DNADNA10倍稀释后-14-ME-PCR/SequencingO=Transferproduct/addreagent/opentubePCR:Real-timeDetectionPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingPCRHetero-duplexCapillaryElectro-phoresisARMS&PNA-LNAclampPCR/SequencingNestedPCR/SequencingPCR/HRMA/dHPLCPCR/RFLPPCRRFLPElectro-phoresisSizingPCRPCRClean-upSequencingRxnCapillarySequencingRFLPOOOOOOOOOOOOTaqManClean-upOClean-upOClean-upOOOOPCRSURVEYORcleavagedHPLCSizingOConfirmationbysequencingPCR/SURVEYORPCRClean-upPyro-sequencingRxnPyroSequencingOO123456Steps7突变检测的各种方法：流程与敏感度ConfirmationbysequencingOConfirmationbysequencingOOO1%~10%3-10%10%3-12%20~30%20~30%1%PCR:Real-timeDetection~10%-15-直接测序法流程及数据分析PCR**纯化测序反应测序仪毛细管电泳纯化数据分析EGFRdeletionEGFRL858R电泳质控组织标本DNA**PCR是关键：--特异性--产物长度--必要时巢式--建议通用测序引物-16-ARMS法基本原理等位基因特异性PCR+荧光探针=ARMS方法A突变DNA模板突变正向引物延伸反向引物G野生DNA模板突变正向引物无延伸反向引物产生荧光信号-17-DNAARMS反应实时定量PCRARMS法操作流程及数据解读数据分析内参信号(HEX)突变信号:+-内参信号:++标本＃1（突变阳性）标本＃2（突变阴性）突变信号(FAM)组织标本内参信号(HEX)-18-DxSARMS与ADxARMSDxSARMSADxARMS生产厂商Qiagen中国厦门艾德公司引物与探针设计蝎形引物与探针双环引物与探针特异引物双扩增检测突变种类29种29种突变判读FAM信号,ΔCt值FAM信号,ΔCt值DNA用量20ng/Rxn10ng/Rxn适用qPCR机型StratageneMx系列,Rotor-GeneQStratageneMx系列,ABI系列,Lightcycler480，…-19-应用比较：DxSARMS与ADxARMS（与张绪超/吴一龙教授等合作共同完成）用于研究的NSCLC病例的临床病理特征Agerange32-83mean61Genderfemale52male63StageIAtoIIIA54IIIBtoIV61SampletypeSurgery74FNA41HistologyAC114AC/SCC1Tumorcontent70%1130-70%4030%11NoQC53检测结果比较EGFR突变ADxARMS检测结果+-totalDxSARMS检测结果+60*2**62-2***5153total6253115检测成功率：均为100%检测结果一致率：96.5%!!!*4例携带的双突变用两种ARMS均测出(2del/T790M,1L858R/T790M,1del/L858R);2例携带的双突变只被ADxARMS测出并经ME-PCR测序法确认(del/L858R);1例携带双突变只被ADxARMS测出但未能经ME-PCR测序法确认(del/T790M);**DxSARMS多检测出1例突变(deletion)且经ME-PCR测序法确认,多检测出的另外一例突变(S768I)但未进行进一步确认(无可用的ME-PCR法)***ADxARMS多检测出2例突变(1deletion,1L858R)且经ME-PCR测序法确认;结论：ADxARMS与DxSARMS具有相近的敏感性和特异性!!!-20-ΔCt窗口野生型非特异扩增对照反应突变反应突变判读-21-测序法与ARMS法比较测序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE标本成功率低高检测流程复杂慢长简单快速数据分析要求高低假阳性机会(交叉污染)多少假阴性机会多少仪器成本高低商用试剂盒无有试剂成本低略高-22-测序法与ARMS法应用实例1.FHirsch,etal.JCO20062.CZhu,etal.JCO20083.TMok,etal.DiscoveryMed2009ISELBiomarker1测序法阴性样本（～200）ARMS法重新检测17(+)测序法复测7(+)BR21后续分析2测序法阴性样本（n=148）ARMS法重新检测11(+)ARMS法是灵敏度更高的方法，测序法的假阴性率约为8%3-23-非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展•用外周血游离DNA(cfDNA)检测肿瘤EGFR突变•用细胞学标本检测肿瘤EGFR突变--癌性胸水--经支气管细针穿刺样本-24-用外周血cfDNA检测肿瘤EGFR突变肿瘤病人外周血cfDNA特点：1.cfDNA血浆中浓度可以很低(10-1200ng/mL)2.cfDNA片段很短(~180bp)，可能多由凋亡产生3.肿瘤释放的cfDNA在总cfDNA中的比例可以很低(3%-93%)核心问题：1.应该用哪种血标本提取cfDNA，血浆还是血清？2.哪种方法适合用于cfDNA突变检测？3.用cfDNA进行突变检测的敏感性与特异性如何？-25-用外周血cfDNA检测肿瘤EGFR突变的文献报告EGFR突变状态血清Total+-肿瘤组织+628-13334Total73542敏感性:75%;特异性:97%.（注：肿瘤组织为测序法检测）ARMS法检测cfDNA中EGFR突变Kimuraetal.BrJCancer2007;97(6):778-784EGFR突变状态血浆Total+-肿瘤组织+15419-01616Total152035数字PCR检测cfDNA中EGFR突变敏感性:79%;特异性:100%.（注：肿瘤组织为数字PCR及测序法检测）Yungetal.ClinCancerRes2009;15(6):2076-2084EGFR突变状态血浆Total+-肿瘤组织+631477-16137153Total79151230PCR/dHPLC检测cfDNA中EGFR突变敏感性:82%;特异性:90%.Baietal.JClinOncol2009;27:2653-2659-26-用血浆还是血清提取cfDNA？（unpublisheddata）cfDNA得率比较血清cfDNA血浆cfDNAEGFR缺失突变（+）EGFR缺失突变（++）