多聚酶链式反应PCR技术

多聚酶链式反应(PCR)一、PCR技术概念：是一种体外快速扩增特异DNA片段的技术。应用：DNA复制原理①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链;③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器.二、PCR技术的原理DNA双链单链变性（加热95℃）复性（缓慢冷却55℃）4、DNA分子的热变性原理：变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合三、使用PCR的前提是：已知目的基因(或DNA片段)两侧的序列，根据该序列化学合成反应必需的双引物。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。四、PCR条件：四种脱氧核苷酸;耐高温的DNA聚合酶;两种引物;模板；缓冲溶液严格控制温度的温控设备。DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入解旋解旋酶加热变性引物引物合成酶外源加入底物细胞内源外源加入DNA聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’-OH端为3’磷酸基团的末端为5’复制的方向：子链的5’端向3’端延伸温泉中水生嗜热杆菌DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在1000C条件下，能保持几个小时。而其最适温度在720C左右。引物引物是决定PCR结果的关键。*引物长度以15～30个碱基为宜，引物过长会影响与模板的退火效率。*(G＋C)含量最好保持在约40%～60%，(G＋C)含量越高退火温度越高，退火温度过高过低都不利于PCR的反应。*两个引物之间不应发生互补。*引物浓度要适宜.用低浓度引物不仅经济，反应特异性也较好。快速、高效、灵活、易于操作五、PCR技术的特点六、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液体内DNA复制和PCR不同点解旋（解旋酶；高温解旋）引物（RNA；人工合成的DNA单链）DNA聚合酶（耐不耐高温）反应环境（细胞内环境；缓冲溶液）六、PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备.2、循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到550C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合PCR循环第二步：引物与靶序列退火③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链.PCR循环第三步：引物延伸第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循环后靶序列扩增的数量七、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增;①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸;八、PCR的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪微量离心管微量移液器（二）、PCR的反应过程每个循环包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环--变性PCR循环—复性PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR循环—延伸PCR整个过程反应程序95℃5分钟，1个循环；95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，30个循环；72℃延伸7分钟。反应产物在4℃保存。反应结束后用紫外分光光度计测定扩增产物的DNA含量或用琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。循环数变性复性延伸第一次95°C，10min－－30次９5℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９5℃，1min55℃，30s72℃，1min讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶紫外分光光度计测定PCR产物含量将PCR产物10倍稀释后，用蒸馏水做空白对照，在260nm处测定稀释后PCR产物的吸光值（A260nm），根据下面的公式计算DNA含量。DNA的浓度(μg/ml)=A260nm0.02×稀释倍数1μg/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02。123M45PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1，2，4，5：PCR产物；3，阴性对照；M,DNA分子量标准（从上向下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。练习巩固1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案‘D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A反复洗涤B不怕外源DNA污染C高压灭菌D在—20℃储存实验小结PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃三、实验步骤：准备好PCR反应体系的配方用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心10分钟将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁②注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s4、离心5、反应②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头.