慢病毒载体的构建

慢病毒载体的构建背景知识病毒载体是一种常使用于分子生物学的工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体（invivo）或是细胞培养（invitro）中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。基因载体系统病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体反转录病毒载体腺伴随病毒载体单纯疱疹病毒载体慢病毒载体裸DNADNA-阳离子脂质复合物DNA-蛋白质复合物细胞内包装细胞外包装DNA-阳离子多聚物DNA/RNA嵌合物背景知识病毒载体产生的原理：最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。病毒载体的包装系统，即将外源基因包装到病毒颗粒中，需要：宿主细胞病毒复制和包装所必须的顺式作用元件和外源基因的表达盒辅助元件，即病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件（辅助质粒、辅助病毒、包装细胞系等）背景知识病毒载体的要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒2、介导外源基因转移和表达3、对机体不致病类型：1、重组型病毒载体（可复制型；复制缺陷型）2、无病毒基因的病毒载体（复制缺陷型）组成：1、病毒复制和包装元件2、病毒基因3、插入的外源基因或元件4、病毒外壳/外膜容量：自身基因组大小的105%~110%病毒载体的纯化：病毒可以看作是一个具有特定结构的生物大分子。病毒的结构复杂，纯化时不能采用蛋白质变性和复性的方法，因为一旦病毒蛋白发生变性，或病毒结构发生破坏，在体外就很难再重建成有感染性的病毒颗粒。因此，在病毒的纯化过程中必须保持病毒的结构不受破坏，并且监测其感染活性。初始物的收集或制备：培养上清和细胞裂解液都可作为纯化的初始物初始物的浓缩：可选用盐析、超滤、透析等方法进行浓缩。目标病毒的分离纯化：氯化铯密度梯度离心法，柱层析法（亲和层析法）背景知识我们现在正在做的病毒载体是复制缺陷型的慢病毒载体（Lentiviralvector），分表达系统和干涉系统实验基本流程：构建含有目的基因的转移载体与2个病毒包装载体共转染293FT细胞进行病毒的纯化、滴度测定侵染目的细胞，表达或干涉目的基因材料：包装载体：pMD2.G、psPAX2的质粒表达系统：pWPXLd的质粒干涉系统：pEN-hH1c、pDSL-hpUGIP的菌种制备感受态用的Top10、Stb13的菌种重组酶（Gateway®LRClonase™II）293FT细胞（＜16代）293FT细胞的培养基及其添加成分（Non-EssentialAminoAcids，L-Glutamine，pyeuvatesolutionandG418）制备感受态用的试剂我们用的慢病毒载体的2个包装载体我们用的慢病毒载体表达系统的转移载体一、空载质粒的验证包装载体及表达载体质粒的验证图1用500ng的pMD2.G、psPAX2、pWPXLd质粒转化Stb13的感受态菌种，培养后进行小提（图A）并酶切验证（图B）ABMMM二、慢病毒载体的包装病毒包装的实验流程（以6孔板为例）第一天：293FT铺板（无抗生素；第二天细胞密度达到80%～90%）第二天：脂质体转染（转移载体+psPAX2+pMD2.G）6-10h换液后开始计时第三天：转染24h后，转染效率应达到70%以上第四天：48h收获含病毒的上清，0.45um滤膜过滤，同时向6孔板中加入2ml完全培养基；1份病毒液+2份完全培养基感染目的细胞第五天：72h再次收获病毒上清，再次感染目的细胞第六天：一般感染48h后可见荧光包装质粒的其他参考比例CytoskeletalanchoringofGLASTdeterminessusceptibilitytobraindamage:anidentifiedroleforGFAP.(JBiolChem,2007,Oct.)慢病毒载体介导人IL-12基因修饰树突状细胞体外抗肺癌作用的研究（邸军，吉林大学博士学位论文，2009年5月）shRNA:psPAX2:pMD2G=20:15:5Duox1isthemainsourceofhydrogenperoxideintheratthyroidcelllinePCCl3(ExpCellRes.,2007,Nov.1)人白细胞介素10基因慢病毒载体的构建及重组(中国普通外科杂志，2008年8月)pWXLd:psPAX2:pMD2G=20:15:6三.滴度测定：稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducingunits”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5mlEP管，每管加入90µl培养液，往第一个管中加入10µl病毒原液，混匀后，吸取10µl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。第三天追加培养液在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（µl）。Lip2000转染293FT细胞的效率图8Des2-1、psPAX2、pMD2G用Lip2000共转293FT细胞，48h后检测GFP的表达情况，如图所示（4×）五、慢病毒载体的验证1、室温3000rpm离心5min，收集上清并过0.45μm的滤膜，以除去混有的细胞或细胞碎片2、将上清转入超速离心管中,4℃、26000rpm超速离心2h。弃上清，用不含血清的DMEM重悬病毒，置-70℃保存病毒溶液的收集与保存病毒上清对不同细胞的侵染效率293FT(10×)293T(10×)图9用Lip2000共转293FT细胞，48h后收集上清侵染细胞，17~24h后换正常培养基，侵染后48h检测GFP的效率，如图所示