2016-6-病毒-1

第三章病毒遗传分析•第一节T4噬菌体•第二节λ噬菌体•第三节反转录病毒1病毒组成病毒virus核衣壳nucleocapsid包膜（来自宿主细胞膜）envelope核酸Nucleicacid衣壳capsidDNARNA2SchematicdiagramofHIV包膜蛋白包膜核酸衣壳核衣壳34病毒的增殖（人类病毒）一病毒复制周期1吸附（absorption)-穿入(penetration)病毒的衣壳蛋白，包膜蛋白，及表面刺突等结构蛋白中的配体位点，可以与寄主细胞表面特异型受体相结合，使病毒吸附到寄主细胞表面。穿入方式多种：有包膜病毒通过包膜与细胞膜融合，核衣壳进入细胞质中。无包膜病毒通过胞饮方式进入细胞质中。52脱壳(uncoating)在进入细胞时，由于细胞溶酶体作用，可以将大多少病毒的蛋白衣壳脱去，释放病毒核酸。少数病毒如痘病毒需要病毒特有的脱壳酶作用，才能脱去蛋白衣壳。3生物合成（biosynthesis)病毒基因组复制，病毒蛋白合成。6•早期基因转录，翻译。产生抑制或阻断细胞生物合成和正常代谢的酶，以及病毒自身的复制酶和晚期转录所需酶等病毒的非结构蛋白。•开始病毒基因组复制•进行晚期病毒基因转录、翻译，合成病毒的结构蛋白。生物合成7•4装配（assembly)与释放(release)DNA病毒多数在细胞核内装配，痘病毒除外。RNA病毒绝大多数在细胞质中装配。无包膜病毒通过烈解寄主细胞而释放子代病毒。有包膜的病毒通过出芽方式而释放。其包膜可以来自核膜或细胞质膜。8第一节T4噬菌体•噬菌体的结构•噬菌体的基因组•基因组DNA复制•遗传分析重组分析互补分析缺失定位•线状基因组DNA环状遗传图谱末端冗余环状排列一步生长曲线单菌释放缺失作图突变热点9第二节λ噬菌体一λ噬菌体的基因组λ噬菌体长48502bp共66个基因，其中32个较为重要线状双链DNA基因组（宿主细胞中呈环状双链）10λ噬菌体线状DNA注入细菌裂解途径att粘端配对RR由宿主细胞的双向复制cos连接酶封闭早期蛋白表达切口早期蛋白不表达Int蛋白表达早期蛋白晚期蛋白不表达蛋白表达A溶原途经cosRAtt线状基因组的多连体cosgalattbioE.coli由A蛋白进行裂解coscosgalattNRcosAJattbio成熟噬菌体颗粒包装到衣壳中图17-λ噬菌体生活史简图1112表1λ主要的位点及基因的功能位点或基因产物及功能PL,OL,PR,OR左右向转录的启动子和操纵子tR(1,2,3,4,5)右向转录的终止子tL(1,2)右向转录的终止子PRECⅠ蛋白建立启动子，受CⅡ蛋白调控PIint′基因启动子，受CⅡ蛋白调控PaQQ蛋白反义RNA启动子，受CⅡ蛋白调控PRMCⅠ蛋白基因维持启动子，受CⅠ浓度调控PR′晚期转录的启动子nutL,nutRN蛋白左右两个反终止结合位点qutQ蛋白反终止结合位点croPL和PR的阻遏蛋白，并可阻遏PE，抑制CI表达cIPL和PR的主要的阻遏物，并可自主调控PEcⅡ可以启动PE、PI和PaQ，使λ进入溶原化途径cⅢ和CⅡ组成复合物，启动PE产生CⅠ及Cro的反义RNA13NtR1,tR2及tL1的反终止蛋白QtR4的反终止蛋白.O,PDNA复制所需的蛋白S,R,裂解宿主所需的裂解酶Int整合酶，使λ整合到宿主的染色体中Xis切除酶，帮助λ在att位点和宿主连接bet,exo重组蛋白，帮助λ和宿主进行重组W,B,Nu3,C,D,E,FⅠ,FⅡ，Z头部蛋白基因U,V,G,T,H,M,L,K,I,J尾部蛋白基因Cos(cohesive)12bp的回文序列，由线状连接成环状的连接点，A蛋白切割位点A末端酶，识别cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组14噬菌体的早，中，晚期转录R3R2R5R1R4PRORcronutRtR1cⅡOPtR2QtR3PR’qnttR4SRAWattintPixiscⅢtL1NnutLPLOLcⅠPRMPREPAQL1L2λ噬菌体的启动子和不同时期的转录1516二裂解周期(LYTIC)------基因表达调控•早期转录：cro蛋白，N蛋白•N蛋白抗终止，次早期（中期）转录，产生CII，O,P,Q蛋白；CIII，xis，int蛋白•Q蛋白抗终止，晚期基因转录，噬菌体最终裂解细胞释放。17①早期基因转录18②N蛋白的抗终止作用，次早期基因转录Cis-actingtLnutLPL/OLPRMPR/ORnutRtR1PREelementscⅢNcⅠcrocⅡGenesPositiveAntiterminatorRepressorAntirepressorPositiveregulatorregulatorFigThelambdanregulatoryregioncontainsaclusteroftrans-actiongfunctinsandcis-actingelements.1920ImmediateearlytranscriptionisterminatedbyrhofactorPromoterTerminatorInitiationElongationTerminatinDelayedearlytranscriptionisextendedbyfactorsthatactatnutCGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCAGCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGTboxAboxBnutNusGNusApNNusB-S10(NusE)InitiationFactorsbindtoRNApolymeraseRNApolymerasecontinuesFig.17-AncillaryfactorsbindtoRNApolymeraseasitpassescertainsites21pN抗终止作用需要寄主因子的协助•通过另一种阻止pN的功能的E.coli的突变而鉴别出nus位点:nusA，nusB，nusE和nusG。•这些nus位点编码的蛋白形成了转录装置的一部分，但却不能从RNA聚合酶中分离出来。nusA，nusB和nusG的功能是单独地和转录终止相关联。•nusE编码核糖体蛋白S10；它在30S亚基中的位置与它在终止中的功能二者并没有什么明显的关系。22•NusA是一个普通的转录因子，它可增加终止的效率。NusA可使pN和RNA聚合酶的核心酶之间相连结。•NusB和S10形成一个二聚体，特异地和RNA的boxA序列相结合。•NusG可能和所有的Nus因子与RNA聚合酶聚集成一个复合体有关。•pN在ρ依赖性终止子上的抗终止需要所有4种Nus因子的功能。23•pN多肽是一种小分子（13.5KDa），碱性，形状是对称的。NusA和pN可能很快地结合，促使pN与RNA聚合酶结合，使其通过nut位点。实现抗终止作用。24③次早期基因转录产生Q蛋白；Q蛋白抗终止，晚期基因转录R3R2R5R1R4PRORcronutRtR1cⅡOPtR2QtR3PR’qnttR4SRAWattintPixiscⅢtL1NnutLPLOLcⅠPRMPREPAQL1L2λ噬菌体的启动子和不同时期的转录25θ复制2627三溶源化途径的建立和维持1、CI蛋白功能：维持溶源化RM：repressormaintenance清晰的噬菌斑（Clearplaquea）2．CI蛋白的结构分子量为27KDa，具有两个功能区(1)N端功能区，1-92aa，操纵基因结合区;(2)C端功能区,132-236aa，负责形成二聚体。28CⅠ蛋白的结构29UV可激活RecA蛋白，活化的RecA蛋白可剪切CⅠ蛋白30溶源化建立过程的基因表达调控•早期基因转录，产生cro,N蛋白•N蛋白抗终止，进行次早期基因转录，产生CII，CIII蛋白•CII在CIII保护下，1)促进PE启动子起始转录，产生CI阻遏蛋白；2)促进PI启动子转录，产生Int酶。•在Int及寄主辅助因子作用下，λ噬菌体DNA整合进宿主染色体中。成为原噬菌体和溶源化细胞。31CII蛋白不稳定，FtsH/HflB水解FtsH以多聚体形式发挥降解CII蛋白的作用其ATPasedomain在识别CII蛋白中起作用分子伴侣方式，在unfold过程中将CII降解CII多聚化可保护其不被降解HflB不是通过改变CII的稳定性起作用。32RNApolymeraseCⅡproteinPL/OLcⅠPRMPR/ORcroPREFig17-repressorsynthesisisestabishedbytheactionofCⅡandRNApolymerasatPREtoinitiatetranscriptionthatthatextendsfromtheantisensestrandofthecⅠgene.最初的CⅠ蛋白的合成是通过CⅡ蛋白激活PRE启动子转录而形成的.(P75L3PRM)33仅被CⅡ结合被CⅡ+聚合酶结合－50－40－30－20－10+10起始点－35顺序为－10顺序为TTGACATATAATGCAACGCAAACAAACGTGCTTGGTATACATTCATAAAGGAATCTACGTTGCGTTTGTTTGCACGAACCATATGTAAGTATTTCCTTAGAT*************cyR突变cyL突变*聚合酶结合位点*影响cⅡ结合图17-21只有在cⅡ存在时(结合在－35区域)RNA聚合酶才和启动子PRE结合(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.13.24)3435LYSOGENYrepressordimerrepressormonomercⅠmRNAOL/PLcⅠrepressorgeneOR/PRRepressorpreventsRNApolymeraseRepressorpreventsRNApolymerasebindsPRMandRNApolymerasefrombindingPLtranscribescⅠfrombindingPRFig17-Lysogenyismaintanedbyanautogenouscircuit.溶源化维持，CI自我调节36λ噬菌体的操纵基因OR和OL各有3个能和阻遏物结合的位点OR1，OR2，OR3，OL1，OL2，OL3。每个位点内17bP组成17bp序列构成了不同的回文结构，回文的对称性和亲和力的大小有关37RNA聚合酶结合位点(PM)LysLysLysThrSerMet-NH2阻遏蛋白AAAGAAAAAACACGAGUApppcⅠmRNAOR3OR2OR1TTTCTTTTTTGTGCTCATACGTTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGAAAGAAAAAACACGAGTATGCAATTTAGATAGTGGCGTTCCCTATTTATAGATTGTGGCACGCACAACTGATAAAATGGAGACCGCCACTATTACCAACGTACpppAUGcromRNARNA聚合酶结合位点(PR)OL3OL2OL1CAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCAGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTTATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGTpppAUCANmRNARNA聚合酶结合位点(PL)图17-18每个操纵基因含有3个阻遏物结合位点，而且在RNA聚合酶结合位点与启动子重叠(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.13.21)38表17-CⅠ和Cro在OR不同区域上的结合浓度CⅠCroGenotypeOR3OR2OR1OR3OR2OR1OR+2521188OR1－55－18－OR2－25－21－8OR1－OR2－25――1――OR1－OR3－－25－－