第九章-转基因动物与克隆动物

第九章转基因动物与克隆动物第一节转基因动物第二节克隆动物第三节转基因动物和克隆动物的生物安全与社会安全第九章掌握内容1、转基因动物和克隆动物的概念。2、基因转移的5种方法。3、动物克隆技术的基本方法。第一节转基因动物一、转基因动物的概念将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。二、基因转移的5种方法：1、显微注射法2、反转录病毒感染法3、胚胎干细胞法4、电脉冲法5、精子载体导入法显微注射法：1、采集受精卵2、向受精卵雄性原核注入DNA溶液3、将2细胞的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的输卵管中4、导入基因的鉴定超排卵母鼠公鼠结扎输精管的公鼠母鼠(一）显微注射产生转基因小鼠××受精卵外源基因已注入受精卵雄性原核向假孕母鼠人工植入受精卵可能带有外源基因片段的小鼠假孕母鼠怀孕母鼠体视显微镜倒置显微镜显微操作系统显微操作图示：1.用透明质酸酶冲洗输卵管壶腹部，使受精卵与输卵管分离，取卵，移入培养皿，在CO2孵箱中培养。2.进行显微操作。使用由三维移动臂控制的持卵针能稳定吸住卵母细胞，显微注射吸管能准确地调整到与持卵针同一平面并成一直线的位置上，此时可对卵母细胞进针。（持卵针）（穿刺针）||（持卵针）（穿刺针）（二）反转录病毒感染法将外源基因DNA插入逆转录病毒载体；通过辅助细胞包装成病毒颗粒，感染胚胎；再将感染的桑椹期胚胎导入子宫。（三）胚胎干细胞法（1）获取胚胎干细胞（ES细胞）；（2）将外源基因导入ES细胞；（3）获取囊胚期胚胎；（4）将含有外源基因的ES细胞注入囊胚期胚胎的腔内；（5）将其移植到假孕动物子宫。（四）电脉冲法利用外界高电压短脉冲使细胞膜产生可逆性穿孔，外源性DNA通过此孔可进入细胞。（五）精子载体导入法以精子作为外源性DNA的载体，通过受精作用将外源性DNA导入受精卵。三、转基因动物的研究概况1、1960年代，将外源基因导入鸡的卵巢和睾丸，得到性状改变的鸡，估计是转基因鸡。2、1974年，美国珍尼斯首次用显微注射法获得体细胞有SV40病毒DNA的小鼠。3、1980年，戈登完善了显微注射技术。4、1982年，帕尔米特将大鼠生长激素基因结构区融合在SM（金属巯蛋白基因（MT）启动子）中，注射到小鼠受精卵雄性原核内，获得体型似大鼠的转基因小鼠。5、1985年，英国拉尔夫布林斯特研制出能生成人类生长激素的转基因猪。6、1989年，意大利拉维特拉纳运用精子载体法转移外源性DNA，获得PSV2—CAT转基因小鼠。7、我国1980年代开始转基因动物研究，成功研制出转基因牛、小鼠、猪、羊、兔、金鱼。新进展：2000年10月，世界首只转基因猴在美国诞生，取名“安迪”，这是世界上首次培育成功转基因灵长类动物。为了能够更有效地研究蝴蝶翅膀的颜色之迷，美国巴法罗大学(UniversityatBuffalo)的生物学家们近日成功地制造出世界上第一只转基因蝴蝶。有意思的是，这只蝴蝶的一些基因是来自水母的。（2004年3月12日）全身散发荧光的转基因鱼四、转基因动物的应用：（一）生命现象的基础理论研究：1、发育生物学研究：通过了解基因的表达、关闭和调控，了解调控顺序。2、遗传学研究观察导入的突变基因的表达，了解基因结构与功能的关系，还可用于基因组印迹分析、遗传缺陷的矫正等.（二）医学研究：1、心血管疾病研究：将转脂蛋白和转纤维蛋白溶酶原等作为外源DNA转入动物体内，建立心血管疾病转基因动物模型。2、肿瘤学研究：肿瘤基因——肿瘤转基因动物模型。3、遗传病研究：导入遗传疾病外源基因，制作遗传疾病转基因动物模型；导入正常基因，弥补基因缺陷所致遗传疾病。4、免疫学研究：用转基因HBsAG小鼠模型研究免疫耐受性的问题。（三）改良和培育动物新品种：使用重组DNA的转基因技术，培育出生长快、产肉、产毛、产奶更多而耗料极少的转基因家畜。（四）研制和生产生物活性物质：将具有医学价值的生物活性物质（如组织型纤溶蛋白元激活因子，tPA）导入家畜或家禽的受精卵，从转基因动物的体液如乳汁、血液、尿液、腹水中收获基因产物。五、转基因疾病动物模型与基因治疗动物模型（一）转基因疾病动物模型：1、病毒性疾病模型：（1）小儿麻痹病毒受体转基因小鼠（2）乙型肝炎病毒携带者模型（3）乙型肝炎表面抗原转基因动物模型2、肿瘤转基因动物模型3、代谢疾病转基因动物模型（1）高歇氏病转基因动物模型（2）家族性神经多发性淀粉样变（FAP）转基因小鼠（二）基因治疗的动物模型：将外源生长激素基因导入“侏儒症”小鼠——个头增大3倍，恢复生育能力。左侧为转移了大鼠生长激素基因的小鼠1982年，RichardPalmiter和RalphBrinster领导的一个小组将一个能够被锌调控的DNA元件与大鼠的生长激素基因连在一起，并将其注射到了受精了的小鼠胚胎中，从而培育出了世界上第一批转基因小鼠。这些转基因小鼠长期取食含有足量锌的食物后，就会长得非常大。转基因小鼠的出现掀起了遗传学研究的新的浪潮。1987年，MartinEvans，OliverSmithies和MarioCapecch领导的几个研究小组对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。这三位科学家因为这项工作在2001获得了Lasker奖。接下来，科学家们用同样的技术又培育出了几千只基因敲除小鼠。第二节克隆动物一、克隆动物的概念——动物通过体细胞进行的无性生殖（也称无性繁殖）以及由无性生殖形成的基因型几乎完全相同的后代个体组成的群体。世界卫生组织在关于克隆的非正式声明中定义为：遗传上同一的机体或细胞系（株）的无性生殖。二、动物克隆技术的基本方法（一）胚胎分割（二）细胞核移植：1.胚胎细胞核移植2.胚胎干细胞核移植3.胎儿成纤维细胞核移植4.体细胞核移植（一）胚胎分割：将胚胎分割成2份、4份。（二）细胞核移植（孤雌繁殖）将一个细胞的细胞核移植到另一个去掉细胞核的卵或细胞中，再移植到雌性动物的子宫中孕育成熟。卵母细胞去核卵母细胞胚胎干细胞或其他细胞的细胞核细胞核移植技术核移植1、胚胎细胞核移植:将单个早期胚胎细胞导入去除细胞核的未受精的成熟卵母细胞，经电融合，使卵母细胞质与导入的胚胎细胞核融合、分裂、发育成胚胎，将胚胎移植给受体继续孕娠。2、胚胎干细胞核移植：胚胎或胎儿原始生殖细胞经过抑制分化培养，让细胞数目增加，但不分化。将单个胚胎干细胞按照（二）1、的方法进行核移植。3、胎儿成纤维细胞核移植：从孕娠早期的胎儿体内分离出胎儿成纤维细胞，按照（二）1、的方法进行核移植。4、体细胞核移植：将动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态，进行核移植。绵羊“多利”就是利用体细胞核移植技术培育成功的世界第一只克隆哺乳类动物。1、从芬兰多塞特白面母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；2、从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；3、利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；4、将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。多莉羊的克隆2003年2月14日，英国苏格兰爱丁堡罗斯林研究所的科学家宣布，全世界第一个克隆动物多利羊已经死亡，活了6年半。当科学家们发现它患上无法治愈的肺病后，决定实施“安乐死”让它长眠。一般说来，一只绵羊平均可以活１１－１２年，而多莉今年只有６岁，寿命仅相当于普通羊的一半。三、克隆动物的研究概况：（1）1952年，用豹蛙囊胚期细胞核进行了核移植，获得可以摄食的幼体。（2）1962年，将非洲爪蟾的小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾去核的未受精卵中，约1%发育为成熟蛙。（3）1986年，用胚胎分裂球与去核未受精卵融合，并用仙台病毒或电激诱导，用核移植技术培育出克隆绵羊。（4）1994—1996年，维尔穆特培育出克隆绵羊“多利”。（5）我国的克隆动物研究：先后培育出克隆山羊、兔、牛、小鼠，曹谊林博士在裸小鼠身上克隆出人耳。克隆牛克隆鼠克隆山羊克隆猫我国首批本土自主克隆牛，这5头出生在山东的克隆牛于2003年8月通过人工授精成功受孕，预产期为2004年4月中旬。这是我国自主完成的体细胞“克隆牛”，首次通过无性方式怀孕。我国首例异种克隆羊2004年1月21日零时在新疆诞生。异种克隆羊不同于世界上第一只克隆羊“多莉”的同种体细胞核移植的克隆方法，而是把A种动物体细胞的细胞核移植到B种动物的去核卵细胞中，生出A种动物。图为1月30日，异种克隆北山羊（右）与接受胚胎的母山羊在一起（左）胚胎细胞克隆兔在广西大学出生过程：先从一只兔子身上获得早期胚胎，注入已去除细胞核的成熟卵母细胞中，融合形成重组胚。重组胚在体外培养后，移入一只雌性兔子的输卵管内，经过34天的正常孕期后，克隆兔（后）顺利降生。意大利科学家2004年6月成功培育出世界上首匹“自体克隆马”（前）。这匹名叫“普罗米塔”的小母马（前）的“妈妈”（后）同时也是其“姐姐”。在2000年美国的《科学》杂志上，科学家宣布，他们使用新的方法成功地克隆了一只恒河猴，该猕猴被命名为“泰特拉”（Tetra），Tetra是希腊词，意义为“四”，看来，科学家以此来暗示他们“一分为四”的方法。这是与人类血缘最近的动物———灵长目动物第一次被成功克隆。科学家希望，使用这种方法能生成基因完全相同的动物，供在研究诸如糖尿病和帕金森病等人类疾病时使用。四、动物克隆技术的意义与应用：（1）生物医药方面：对能够生产抗凝血酶、血清白蛋白等的转基因动物进行克隆，大批生产该药。（2）医学方面：利用克隆技术培育模型动物（高血压等），直接克隆出人的心、肝、肾等器官，供器官移植。美国密苏里大学通过克隆技术培育出四只含有荧光水母基因的小猪。五只小猪中有四只小猪的猪嘴和猪蹄呈荧光黄色（左），剩下的一只小猪（右）和正常小猪无异。专家们称，荧光小猪的成功培育对培育动物器官用于人体移植具有重要意义。（3）畜牧业方面：选育良种后进行克隆，加快培育良种的速度。（4）保存物种：保存或克隆大熊猫等珍稀濒危动物。附：该不该克隆大熊猫权威专家不支持克隆大熊猫具体理由有3个：一、克隆大熊猫本身还有缺陷或者说不很完善、成熟。特别是在异种动物的克隆技术上的困难更多，比如在其他家畜上的研究表明，一般情况下异种动物克隆的胚胎发育到囊胚阶段后就会停止发育，这个问题到现在无法解决。二、就现在成功的克隆动物研究例子来说，其成功率也极低，异种动物的克隆目前尚未有个体成活的报道。三、即使克隆技术完善了，异种动物的克隆技术成功了，类似大熊猫这样的濒危物种也不可能靠其得到拯救。因为克隆动物只是个体的复制，它根本无利物种本身的遗传多样性保护。与其把有限的资金花到这种前景不明的项目，不如集中精力搞好大熊猫就地和异地保护。目前鼓动大熊猫克隆之说，无异于舍本求末。美国科学家2003年5月宣布培育出一头克隆骡子（左）。这头小公骡被取名为“爱达荷宝石”。它头上戴有3个“世界第一”桂冠：第一个克隆的骡子，第一个克隆的马科动物，第一个克隆的杂种动物。科学家们说，该成果将有助于克隆其他自身繁殖有困难的濒危动物，对研究癌症等疾病也有重要的参考价值。骡子体内包含63个染色体，是有62个染色体的公驴和有64个染色体的母马所生的种间杂种，通常情况下没有生育能力。研究发现，细胞内的钙含量会对马科动物细胞生长和繁殖产生重要影响，马科动物繁殖过程中细胞内钙含量格外高。科学家们基于这一发现对实验进行了改进，提高了克隆骡子胚胎培养液的钙浓度，最终成功培育出“爱达荷宝石”。科学家们说，同样的方法对克隆其他马科动物应该也适用。2003年12月22日，美国得克萨斯农业和机械大学公布了世界上第一头克隆鹿的照片。这头取名为“杜威”的白尾小鹿于2003年5月23日出生，是该校兽医学院和Viagen公司合作培育的产物。这一成果被认为