液相色谱教程

1、液相色谱基础知识（一）色谱原理及分类历史回顾1906‘s-MikhailSemenovichTswett(1872-1919)0NNNNMgCHCH23CH3CH3HC30CH3CH3CH30CH300碳酸钙吸附剂石油醚1940‘s-分配色谱和纸色谱1950‘s-气相,薄层，凝胶过滤色谱梯度洗脱色谱M.S.Tswett.Ber.Dtsch.Bot.Ges.24:384-393(1906)1960‘s-商业高效液相色谱.柱色谱装载样品装载溶剂重力洗脱玻璃柱硅胶氧化铝纤维素糖类粉末滤网1050100150Volume(mL)Time(hr)1.02.03.04.0高效液相色谱进样口检测器色谱图色谱柱溶剂泵混合器(HPLC)SeparationsInjectorDetectorColumnSolventsMixerPumpsChromatogramStartInjectionmAUtimeHighPerformanceLiquidChromatographSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsMixerPumpsChromatogramStart。

2、InjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramS。

3、tartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatog。

4、ramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtimeSeparationsInjectorDetectorColumnSolventsPumpsMixerChromatogramStartInjectionmAUtime（二）基本概念和术语液相色谱名词术语（五）分离原理术语理论塔板数（N）：用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。是分离效率的量度。分离度（R）：相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。（三）液相色谱仪的组成液相色谱仪的组成硬件部分输液系统进样系统分离系统检测器软件部分——色谱数据处理系统输液系统包括溶剂柜、真空脱气机、溶剂混合器、高压泵等，其中核心部分是泵；泵的作用：提供足够的驱动力使流动相通过填充紧密的色谱柱洗脱方式等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱：采用两种（或多种）不同。

5、极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相的浓度配比和极性的一种洗脱模式。用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。进样系统作用：把分析试样有效地送入色谱柱进行分离要求：进样量重现性好分类：自动进样器、手动进样器手动进样器常用六通阀（以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见）进样量应不小于定量环体积的5－10倍（最少3倍）ToWasteSampleLoop(FixedVolume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFromPumpToWaste手动进样器－六通阀前视图进样后视图加载-进样样品定量管手动进样器样品输入溶剂入口溶剂出口加样进样从泵到柱样品输入溶剂入口溶剂出口从泵到柱手动进样器分离系统包括色谱柱、柱温箱等色谱柱是一根填满填料的管子色谱柱的材料有不锈钢、塑料、玻璃等，主要是不锈钢材质；尺寸（内径、长短）不尽相同；色谱柱填料主要有硅胶基质和聚合物基质，填料的粒径不尽相同。检测器要求：灵敏度高、重现性好、线性范围宽、死体积小、对温度及流量的变化不敏感等主要有紫外检测器、荧光检测。

6、器、示差检测器等检测器使用统计43.0%22.0%10.0%8.0%7.0%5.0%1.0%4.0%UV-VISDADFluorescenceRefractiveIndexElectrochemicalConductivityMassspecOthers紫外检测器固定波长检测器可变波长检测器光电二极管阵列检测器（PDA）PDA是80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质），色谱用于定量。常用于复杂样品的定性定量分析。示差检测器是一种通用型检测器，理论上可以检测几乎所有的化合物其原理是基于含样品的洗脱剂和洗脱剂二者折光指数的差异。示差检测器受压力变化、温度变化、流动脉冲的影响较大，不适合进行梯度洗脱。（四）固定相和流动相填料基质无机物基质：硅胶、氧化铝硅胶是HPLC填料中最普遍的基质硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2－8有机聚合物基质化学键合固定相将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。化学键合相按键。

7、合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用作正相色谱；常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1－C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。流动相的性质要求低粘度与检测器兼容性好易于得到纯品低毒性色谱柱对流动相的要求溶剂使用前都必须经0.45µm（或0.22µm）滤过，以除去杂质微粒；使用超纯水，或用高锰酸钾处理过的双蒸水；有机溶剂需用色谱纯并与填料相匹配；缓冲盐pH值在填料允许范围之内，一般为pH2～8；缓冲盐浓度低于100mM；对样品的溶解度要适宜，最好用流动相溶解样品。（如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。）液相色谱仪器对流动相的要求与检测器匹配；流动相必须预先脱气；避免用含卤素离子的缓冲液；溶剂的粘度要低；防止细菌的生长。流动相的pH值分析弱酸样品时通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三。

8、乙胺溶液。避免用含卤素离子的缓冲液；流动相中加入有机胺可以减轻或消除峰拖尾现象。这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。流动相脱气的方法加热——简单，同抽真空一起使用，效果很好，但容易造成流动相组成的变化；抽真空——一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果；超声波振荡——简单，一般时间不要太长，1－5分钟即可，此法不影响溶剂组成；通惰性气体——氦气昂贵，难于普及；在线脱气机流动相的过滤使用前必须经0.45µm（或0.22µm）滤过，以除去杂质微粒注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。有机溶剂流动相宜室温下密封，避光保存；缓冲液流动相易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。有机溶剂与水（缓冲液）混配的流动相，宜低温密封保存，防止有机相的挥发。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液。

9、的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。（五）定性定量分析定性分析同一分离条件下，保留时间相同的物质可能是同一物质，但保留时间不同的物质肯定不是同一物质。液相色谱定量分析的原理在定性的基础上定量,需要有纯物质作为标准物液相色谱定量是相对定量的方法，由已知量的纯标样推算混合物中被测物的量液相色谱定量的依据是被测组分的量与响应值（峰高或峰面积）成正比常用的定量方法标准曲线法，分为外标法和内标法面积归一法（六）高效液相色谱仪的操作液相色谱仪操作流程1、开机依次打开脱气机、色谱泵、检测器、计算机电源；待各设备自检正常后，启动色谱管理系统；2、流动相准备过滤脱气3、色谱泵排气4、安装色谱柱液相色谱仪操作流程5、流动相平衡如有机溶剂与缓冲盐溶液切换等易产生沉淀的情况，需先使用90%超纯水/10%甲醇作为流动相冲洗系统6、数据采集、进样7、冲洗管路及色谱柱8、数据处理9、关机10、记录相关信息（七）维护与保养泵的使用和维护注意事项①流动相需过滤，溶剂过滤头、在线过滤器应经常检查、清洗或更换。目的：防止任何固体微粒进入泵体，因为尘。

10、埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。泵的使用和维护注意事项②常用缓冲盐时，停泵前必须泵入纯水将泵充分清洗，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇－水）。目的：流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。泵的使用和维护注意事项③更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性，如不溶，要用一种中间溶剂过渡。④泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。⑤输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。⑥流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。⑦关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准。六通阀使用和维护注意事项①进样时，进样量应不小于定量环体积的5－10倍（最少3倍）②进样一。