液相色谱讲义二：液相色谱的方法开发-分离机理及色谱柱

液相色谱的方法开发分离机理及色谱柱选HPLC参数时的基本考虑溶解度-选择流动相的条件分子量-在样品预处理或GPC分析时有用官能团-有否离子化基团?保留特性如何?样品的基质-考虑如何前处理在基质中样品的含量-分析、制备都考虑检测特性-有否紫外吸收?荧光?找出样品中不同组份之间的差异摸索条件的重要线索极性问题液相色谱的分离机理正相反相体积排除离子交换其他不同的分离模式是不同的机理吸附色谱的分离机理•随着样品在固定相上的吸附能力由大到小•在色谱柱上的保留由长到短吸附色谱概述分离基于样品的极性差异。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱常用的流动相∶非极性有机溶剂，如己烷乙酸等为添加剂常用固定相∶硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。分配色谱的分离机理分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相多为键合相?键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点∶固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点∶pH值不能小于3同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同体积排除色谱的分离机理凝胶色谱概述凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）分离基于分子在溶液中的体积大小洗脱次序：大分子先被洗脱流动相不参与分离，只起溶剂作用分离效率低色谱行为容易预测GPC的校正分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离离子交换树脂的分离机理离子交换色谱概述适用于离子型化合物的分离分离基于离子的带电特性洗脱次序受多种因素的影响填料（离子交换树脂）的种类∶阴/阳，强/弱，交换基团样品分子特性盐的种类、浓度温度及pH值有机溶剂SPCSPCSPSPt样品填料离子交换树脂的交换容量液相色谱柱及分离机理的关系从色谱方法上分正相/反相离子交换分子体积排除亲合疏水回受从柱子类型上分分配/吸附离子交换凝胶亲合色谱柱化学及外形结构的关系液相色谱柱填料柱管颗粒表面性质颗粒度长度内径材料化学性质∶k，分辨率机械因素∶N寿命，柱效，速度，溶剂消耗对HPLC柱的了解平均颗粒度，颗粒度分布颗粒度(dp)颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)颗粒分布颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差)颗粒形状球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀无定型：柱床结构不均匀流动相线性速度不均匀谱带扩展对HPLC柱的了解（二）平均孔径/孔体积孔径/孔体积分布大的孔径可分析高分子量的分子对HPLC柱的了解（三）键合相化学影响化合物的分离度：不同键合相对不同种类的化合物分离不同可能导致色谱的分离机理不同如：C18、C8、CN对HPLC柱的了解（四）含碳量含碳量越高，k‘值越大（固定相传质效应增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好，重现性好有利于极性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗不同色谱柱的含碳量色谱柱C%k‘苊(50/50的乙腈/水)SymmetryC181917ZorbaxODS1715.7LiChrosorbRP-181510.3SymmetryC81212.5ResolveC-181212.4UltrasphereODS1111.3PartisilODS-31112.0mBondpakC-18107.9Nova-PakC-1875.5对HPLC柱的了解(五)填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）残基处理的效果NovaPakC18未封口C18①抗坏血酸②烟酰胺③对氨基苯甲酸④哌咯西叮⑤核黄素⑥苯酚⑦盐酸硫胺对HPLC柱的了解（六）硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：k'生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同是选择性差异的主要来源硅胶的杂质含量重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小是色谱柱质量好坏的重要标志对HPLC柱的了解（七）填料的稳定性硅胶填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2时键合相水解123456789pH硅胶的溶解曲线Waters各种硅胶基质的色谱柱C1C4C6C8C18PhenylCNNH2mBandaPakResolveNova-PakDelta-PakSymmetrySpherisorbWaters不同品牌的色谱柱mBondaPak文献背景强,是工业标准平均孔径125A，10m高活性、无定形硅胶中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性Nova-Pak平均孔径60A，4m高韧度低活性球形硅胶低酸性，高疏水性，好的端基封口有利于小分子物质的分析Waters不同品牌的色谱柱Resolve平均孔径90A，5/10m低活性硅胶非常高的疏水性，无端基封口有利于低保留的中性及酸性化合物分离Delta-Pak有100A和300A两种孔径，5/15m硅胶中到高的疏水性，端基封口适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱新一代硅胶基质的色谱柱Symmetry高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均10ppm孔径100A，5m球形颗粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面积：300m2/g孔体积：1mL/g特点好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长Waters聚合物基质的反相柱特殊设计的多孔聚合物胶有很宽的pH适应范围（2-12）可用离子抑制方法分析碱性化合物有非常不同的选择性柱效及韧性比相应的硅胶柱低色谱机理不太清楚文献背景低，用户少色谱柱的规格内径检测的灵敏度样品的容量长度分离度，理论塔板数速度样品的容量检测的灵敏度