生物技术专业复习资料(西南民大版)生物工程下游技术

1.生物下游加工过程：目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化。重要性：一个生物技术成果转变为具有竞争力的产品的重要因素。2.生物分离难度大：粗产品常存在于复杂的多相体系中，成分复杂；固体成分包括完整有机体、培养基及底物中的不溶物；液体成分包括底物可溶物、代谢中产物及目标产物。悬液中的目标产物浓度低；产物稳定性差：a化学降解(pH,温度);b微生物降解（酶作用，染菌）。3.生物分离的四步：固液分离：发酵液预处理、过滤、离心，主要作用：对产物起到浓缩的效果；产物粗分离：沉淀法、吸附、膜分离技术、萃取，主要作用：特异性分离程度不高，只是进行初步分离；产品的纯化：各类层析技术（亲和，疏水，凝胶过滤，离子交换）、电泳，主要作用：对产物高度特异性选择，去除杂质；产品的成品化：结晶、干燥（喷雾干燥，气流干燥，沸腾干燥，冷冻干燥）、制剂，主要作用：便于产品的保存与运输，辅助治疗。4.分离技术选择的基本原则：1)、尽可能简单、低耗、高效、快速。2)、分离步骤尽可能少。A)、φn为总回收率，λn为各单元回收率。分离步骤越多，回收率越低；如φ10=0.9510=0.63，φ5=0.955=0.77B)、分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长。5.分离技术选择的技巧：1)、避免相同原理的分离技术多次重复出现例如：分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。2)、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。A)、引起新的化学污染；B)、蛋白质的变性失活3)、合理的分离步骤次序。原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。6.分离效果的评价：回收率=纯化后的目标蛋白总量/纯化前的目标蛋白总量，纯化倍数=纯化后的蛋白比活/纯化前的蛋白比活。对于具有生物活性的蛋白质或酶，常用分离前后目标产物的比活之比表示目标产物的分离纯化程度。比活的定义：在一定条件下，单位质量(mg)的酶活力[U/mg]7.无血清培养基优点：①提高重复性②减少微生物污染③供应充足稳定④产品易纯化⑤避免血清因素对细胞的毒性⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰。无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。8.任何动物细胞培养均从原代培养开始。培养过程：处死动物--将组织块剪碎--Hanks液--冲下剪刀上的碎块，补加3-5mLHanks液--吹打、低速离心、弃上清液、留下组织块：组织消化--吸管取出细胞悬液放入培养瓶内，加入培养液--培养--传代。9.根据细胞生长的特点，传代细胞培养有3种：1．悬浮培养2．贴壁培养3.固定化培养。10.细胞计数：培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。1.细胞计数板2.MTT比色法。11.细胞大规模培养的操作方式：培养方式分为：分批式、流加式、半连续式、连续式、灌注式。12.流加式培养：在批式培养过程中不断补入营养物，以解决营养物的抑制及不足问题。流加方式：(1)无反馈控制流加(2)反馈控制流加特点：避免某种营养成分的初始浓度过高；能防止营养成分在培养过程中被耗尽；整个过程反应体积是变化的。13.细胞保存：细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。冻存和复苏的原则：慢冻快融。14.生长速率：倍增时间一般为0.5-2h倍增时间一般为12-60h。15.灌注培养：是把细胞接种后进行培养，新鲜的培养液从反应器一头不断加入，从另一头不断取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。特点：高密度培养动物细胞。16.动物细胞大规模培养反应器：类型及其基本结构：⒈搅拌式生物反应器⒉气升式生物反应器⒊中空纤维式生物反应器⒋透析袋或膜式生物反应器⒌固定床或流化床式生物反应器。17.用于动物细胞的生物反应器应具备的基本要求：(1)混合系统设计应能提供均匀、温和的混合状态，剪切力小，保证良好的传质效果。(2)反应器内空间利用率高，选用合适的载体系统和材料。(3)能严格保证无菌环境。(4)能精确地控制温度、酸碱度、溶解氧和C02浓度等条件。(5)能够方便地实现培养液的连续添加、样品的采样和观察。18.发酵液预处理，其目的不仅在于分离菌体和其他悬浮颗粒，还着眼于除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利进行。微生物发酵液的特性可归纳为：①发酵产物浓度较低，大多为1%~10%，悬浮液中大部分是水；②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；③固体粒子可压缩性大；④液相粘度大；⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。方法：一、降低液体粘度，根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，可见降低液体粘度可有效提高过滤速率。降低液体粘度的常用方法有加水稀释法和加热法等。二、调整pH，pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。三、凝聚与絮凝，采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。除此之外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。因此，凝聚和絮凝是目前工业上最常用的预处理方法之一四、加入助滤剂，助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。这是因为使用助滤剂后，悬浮液中大量的细微胶体离子被吸附到助滤剂的表面上，从而改变了滤饼结构，它的可压缩性下降了，过滤阻力降低了。五、加入反应剂，加入某些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。19.杂蛋白质的除去：改善发酵液过滤特性的方法中，其中许多方法可在改善过滤特性的同时，除去杂蛋白质，下面再介绍几种常用的方法：(1)沉淀法，蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。(2)变性法，蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性，变性蛋白质的溶解度较小。(3)吸附法，加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。20.细胞破碎方法及其原理：机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法、研磨法、匀浆法、超声法。物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法、压力差破碎法。化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。有机溶剂、表面活性剂、酸碱。酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。自溶法、外加酶制剂法。三、几种常用的破碎方法：1、高压匀浆法2、高速珠磨法3、超声破碎4、化学渗透法5、酶溶法6、微波加热法。微波是频率介于300MHz和300GHz之间的电磁波，微波加热法（microwaveheating）是利用微波场中介质的偶极子转向极化与界面极化的时间与微波频率吻合的特点，促使介质转动能级跃迁，加剧热运动，将电能转化为热能。21.选择破碎方法的依据：细胞处理量；细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；目标产物的选择性释放选择性释放目标产物，使其他物质尽量少地释放出来，并尽量降低细胞的破碎程度，对下游分离纯化有利。22.包含体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。23.目标蛋白的变性溶解：包含体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性剂才能使其形成可溶性的形式。常用变性剂：▲5-8mol/L盐酸胍或6-8mol/L尿素,作用：破坏离子间相互作用；▲表面活性剂如1-2％SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。▲PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类浓度。25.目标蛋白的复性：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。复性方法：稀释法除变性剂－加入大量水或缓冲液。膜分离法除变性剂－透析、超滤、电渗析。层析法－凝胶层析，高效疏水层析。26.固液分离：一、离心沉降二、微孔膜过滤三、双水相萃取四、泡沫分离法五、避开固液分离的探索——扩张床吸附。27.切向流过滤：在一般过滤中，滤液的流动方向与滤饼基本垂直，称为封头过滤。切向流过滤(Cross-FlowFiltration)又称错流过滤、交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体(滤饼)移走。当移走固体的速率与固体的沉积速率相等时，过滤速率就近似恒定。28.溶剂萃取法是利用一种溶质组分(如产物)在两个互不相溶的液相(如水相和有机溶剂相)中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行分离的操作。29.超临界流体萃取：超临界流体：当一种物质处于其临界点以上的温度和压力之下，则称之为超临界流体。物质的临界状态是指其气态和液态共存的一种边缘状态。利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，在低密度条件下使萃取物得到分离。30.双水相萃取技术：向水相中加入溶入水的高分子化合物，形成密度不同的两相，轻相富含某一种高分子化合物；重相富含盐类或另一种高分子化合物。因两相均含有较多的水，所以称之为双水相萃取。双水相萃取的优点：核酸等大部分杂质一般处于下相，可以同时除去。下相是无机盐富集相，费用较低。蛋白质产物分配在上相有利于保持其活性（PEG保护作用），而下相的高盐浓度会造成产物失活或沉淀。碎片在下相有利于用连续式离心机分离。31.反胶团萃取：向溶剂中加入表面活性剂，当表面活性剂的浓度超过一定值时，在溶剂中会形成胶团。胶团或反胶团的形成均是表面活性剂分子自聚集的结果，是热力学稳定体系。微胶团：水溶液中表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”；反胶团：有机相中表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”。29.浸取：溶剂从固体颗粒中浸取可溶性物质，其过程一般包括以下步骤：(1)溶剂从溶剂主体传递到固体颗粒的表面；(2)溶剂扩散渗入固体内部和内部微孔隙内；(3)溶质溶解进入溶剂；(4)通过固体微孔隙通道中的溶液扩散至固体表面并进一步进入溶剂主体。30.盐析：概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。31.等电点沉淀法：在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀。不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。32.有机溶剂沉淀法：概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点:1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。33.34.膜分离的特点：①操作在常温下进行；②是物理过程，不需加入化学试剂；③不发生相变化（因而能耗较低）；④在很多情况下选择性较高；⑤浓缩和纯化可在一个步骤内完成；⑥设备易放大，可以分批或连续操作。因而在生物产品的处理中占有重要地位。35.浓差极化:在膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面上，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作