pET载体

pET载体，原核表达金标准对于全世界许多研究者，Novagen的pET系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T7启动子之下，因此在加入T7RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到pET载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入IPTG诱导表达；也可通过lCE6感染原始克隆宿主菌来提供T7RNA聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统(如tac、lac、trc、pL)有困难的许多基因已经在pET系统中稳定克隆和表达。T7RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50%。新开发的T7驱动表达技术以pETBlueTM系统为代表。pETBlue载体包括了pET用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒DNA操作的方面更为方便。pETBlueTM系统：新一代T7表达载体pETBlue载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和T7驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌tet启动子的反义方向插到lacZa-肽编码区，因此可进行蓝/白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的T7转录和翻译信号使表达成为可能。与标准pET载体一样，通过转化λDE3溶原菌并用IPTG诱导或通过lCE6感染原始宿主菌生产目标蛋白。优点·蓝/白斑筛选，便于克隆·高拷贝数，质粒DNA高产·以AccepTorTM载体或perfectlyBlunta载体形式提供，便于快速PCR克隆·目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性·表达水平与经典pET载体相同·用TunerTM(DE3)pLacI宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。PET系统：大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌pET载体中，目标基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7RNA聚合酶来诱导表达。Novagen的pET系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36种载体类型、15种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。优点·是原核蛋白表达引用最多的系统·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低·真正的调节表达水平的“变阻器”控制·提供各种不同融合标签和表达系统配置·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌·许多载体以LIC载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR产物·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性pFORCETM克隆系统具有高效克隆PCR产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。pETBlueTM系统T7驱动的严紧控制表达、蓝/白斑筛选、质粒产量高新颖的pETBlueTM系统兼有广受欢迎的蓝/白斑筛选载体所具有的通过目测确定重组体和高质粒拷贝数，以及pET载体严紧控制的高蛋白表达等特点。蓝/白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子(tet)驱动lacZa-肽表达而实现，而目标基因表达由相反方向的T7启动子驱动。目标序列插入多克隆位点（MCS）破坏了lacZa-肽的表达，在NovaBlue菌株中当存在x-gal时产生白菌落表型，而带有非重组载体的菌落变蓝。由于T7驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于tet启动子的反义方向，因此实际上没有目标序列的基础表达。相对于pET载体，pETBlue质粒上高拷贝PUC复制起点增加了质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。如果插入序列相对于T7lac启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求，pETBlue载体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达：用lCE6（lpL启动子控制T7RNA聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组pETBlue质粒到宿主菌TunerTM(DE3)pLacI或OrigamiTM(DE3)pLacI中并用IPTG诱导。这些宿主菌染色体上带有一拷贝lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，并通过相容的pLacI质粒提供足够lac阻遏蛋白，以确保低水平的未诱导表达。Tuner菌株的lacY状态使整个培养细胞被均一的诱导，并随IPTG剂量诱导有不同的蛋白表达水平。Origami菌株能够增强胞质中二硫键形成。pETBlue-1pETBlue-1便于从5'端编码开放读码框架的插入片段表达未融合的天然蛋白。该载体EcoRV(GATATC)克隆位点位于强T7基因10核糖体结合位点（RBS）附近。含有ATG起始密码子或5'端具有一个位置合适的G核苷酸插入片段成为一个合适的大肠杆菌翻译起始位点。pETBlue-2pETBlue-2提供了载体编码的ATG起始密码子和多种下游克隆位点。MCS5'和3'端两套各三个重叠平末端酶切位点便于将任何插入片段克隆到读码框中。在载体确定的读码框中，这些酶产生的平末端终止于密码三联体的不同位置。因此只要插入方向正确，任何插入片段可克隆到经过合适平末端酶切割的载体的读码框中。而且，任何不含内部终止密码子的插入片段都可与C-末端HSV.Taga表位和His.Taga序列克隆到同一读码框中。pETBlueTMPCR克隆试剂盒方便地将PCR扩增DNA直接克隆到pETBlue载体中除了含有未切割质粒的pETBlueTM系统，Novagen还提供可立即插入PCR产物的pETBlue载体。已有两种试剂盒：AccepTorTM载体试剂盒能够插入带单个3'-dA突出的DNA，如非校对DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的扩增产物；而perfectlyBlunta克隆试剂盒设计用于克隆任何末端形式的插入片段。在pETBlue-1AccepTor载体中表达插入基因的引物设计：pETBlue-1：用5'端ATG开始的正义引物进行扩增，能够确保在大肠杆菌中有效合成蛋白的RBS和翻译起始位点之间的最适距离。目标序列羧基端引物设计没有限制。Met---正义引物5'-ATGXXX---反义引物无限制pET系统概述pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier等开发的T7启动子驱动系统，Novagen的pET系统已用于表达成千上万种不同蛋白。控制基础表达水平pET系统提供6种载体-宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7RNA聚合酶基因的宿主菌（λDE3溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3溶原菌中，T7RNA聚合酶基因由lacUV5启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS和pLyE时调控会更严紧。pLys质粒编码T7溶菌酶，它是T7RNA聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS宿主菌产生低量T7溶菌酶，而pLysE宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3溶原菌。有11种不同DE3溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon和ompT蛋白酶。B834菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR为recA-衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变菌株(AD494,BL21trxB)，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。OrigamiTM和OrigamiB菌株为trxB/gor双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami和OrigamiB宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的RosettaTM菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12菌株HMS174和NovaBlue，象BLR一样为recA-。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F附加体编码的高亲和力lacIq阻遏蛋白，NovaBlue为一个有用的严紧型宿主菌。此外，Novagen提供了λDE3溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的λDE3溶原菌的另一替代方法是通过lCE6感染提供T7RNA聚合酶。虽然不如用IPTG诱导λDE3溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。高严紧性T7lac启动子除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，pET系统中T7启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通T7启动子和T7lac启动子。T7lac启动子在启动子区下游17bp处含有一个25bp的lac操纵序列。该位点结合lac阻遏蛋白能够有效降低T7RNA聚合酶的转录，这样提供了在λDE3溶原菌中抑制基础表达的第二种基于lacI的机制（除了抑制lacUV5）。含T7lac启动子的pET质粒还具有它们自己的lacI，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体/宿主菌组合。控制诱导的表达水平在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体/宿主菌组合控制T7RNA聚合酶的基础表达提供不同严紧性，pET系统还根据诱导物（IPTG）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。Tuner和OrigamiB宿主菌的lacY突变使这种控制成为可能。选择pET载体所有的pET载体均来自pBR322，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类pET质粒，即转录载体和翻译载体：转录载体（包括pET-21、pET-23和pET-24）表达目标RNA，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框a、b和c中带有克隆位点，分别对应于BamHI位点的GGA、GAT和ATC三联体。选择要点选择用于表达的pET载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：·所表达蛋白的用途·所表达蛋白的已知信息·克隆策略pET载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多pET载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。LIC（连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子Xa能够去除所有氨基端载体编码序列。由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多pET载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采PCR克隆策略时则有不同的考虑。LIC载体试剂盒推荐用于此目的，可通过PCR制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。溶解性和细胞定位考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被