5-13-现代生物技术与人类健康

现代生物技术与人类健康5-131生物技术与疫苗2生物技术与疾病诊断3生物技术与生物制药主要内容1生物技术与疫苗2生物技术与疾病诊断3生物技术与生物制药主要内容广义的疫苗是指将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。由细菌制成的称为菌苗；由病毒、立克次体、螺旋体等制成的称为疫苗。1生物技术与疫苗1.1疫苗概说•公元10世纪，在宋朝的真宗时代，我国就有了接种人痘预防天花的记载。•1796年英国医生Jenner发现用牛痘代替人痘接种同样可预防天花。特点：直接用未减毒的病原体作为疫苗。疫苗的发展历史早期疫苗第一代疫苗（弱毒苗或灭活苗）19世纪中叶，法国科学家Parsteur首先发明了减毒疫苗的制备技术。用病原体减毒或弱化制成疫苗，称之为第一代疫苗。特点：以减毒、弱化或灭活的病原体做疫苗。第二代疫苗(基因工程疫苗)将病原体的抗原（某种蛋白质）基因克隆在细菌或真核细胞内，利用其生产的病原体抗原作为疫苗。特点：利用病原体的某些抗原成分作为疫苗。基因工程幽门螺杆菌疫苗第三代疫苗(核酸疫苗)将含有编码病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。特点：用含有病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗。DNA疫苗质粒肌肉细胞抗原基因肌肉细胞表达抗原蛋白DNA疫苗的优点①DNA接种载体(如质粒)的结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，因而生产成本较低，且适于大批量生产；②DNA分子克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据需要随时进行更新；③DNA分子很稳定，可制成DNA疫苗冻干苗，使用时在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存；④比传统疫苗安全，不存在减毒疫苗毒力回升的危险；⑤质粒本身可作为佐剂，因此使用DNA疫苗不用加佐剂，既降低成本又方便使用；⑥将多种质粒DNA简单混合，就可将来源于相同病原菌的不同菌株的多种不同抗原结合在一起，组成多价疫苗，从而使1种DNA疫苗能够诱导产生针对多个抗原表位的免疫保护作用，使DNA疫苗生产的灵活性大大增加。AbAg静止B细胞辅佐细胞(巨噬细胞）静止T细胞病原微生物激活记忆B细胞浆细胞活化的T细胞激活1.2免疫系统及疫苗的作用机理1981年Edman等克隆了该抗原基因并大量表达。1986年美国批准酵母表达系统生产表面抗原疫苗上市。以色列等国采用仓鼠细胞生产疫苗。我国可采用以上两种表达系统生产疫苗。1.3.1肝炎病毒疫苗乙型肝炎病毒（HBsAg）1.3病毒性疾病的疫苗•国外已有甲型肝炎病毒灭活疫苗面市。•我国使用的减毒疫苗也取得了很好的效果。•国内基因工程空壳甲肝病毒及痘苗活病毒疫苗也显示了很好的免疫原性。•2001年美国批准甲乙型肝炎联合疫苗上市。甲型肝炎病毒•临床症状上与甲肝相似,患者有明显的乏力、食欲减退、恶心、呕吐，部分患者可出现黄疸。•接种疫苗是预防戊肝的最好办法。不过，迄今为止世界上仍未有疫苗获批上市。厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心科研人员经过艰苦的联合攻关，首次成功地利用大肠杆菌表达系统获得了戊型肝炎类病毒颗粒，目前正准备进入III期临床试验。戊型肝炎病毒•丙型肝炎是由丙肝病毒（HCV）所引起，是通过输血或血制品、破损的皮肤和黏膜、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。丙型肝炎病毒感染后，大部分患者转为慢性肝炎，其中部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌。对感染者的危害远大于乙肝病毒感染。丙型肝炎病毒（尚无疫苗）•由于丙型肝炎病毒目前尚未能培养成功。而且丙肝病毒还存在着高突变率，尤其是包膜区的多变性，目前已知至少存在6种不同基因型的病毒，各型之间的异源性高达25%～30%，给丙肝疫苗的研究带来了重重困难。这也是为什么至今仍未见有丙肝疫苗上市的原因之一。丙型肝炎病毒（尚无疫苗）1.3.2艾滋病病毒疫苗HIV模式图•艾滋病疫苗的研究主要是通过克隆病毒外膜蛋白和gp160及gp120基因后在不同的表达系统中表达，以获得基因工程疫苗。目前该疫苗大多处于临床试验阶段,尚未大规模使用。电子显微镜下的HIV小儿麻痹症疫苗小儿麻痹症是由脊髓灰质炎病毒引起的中枢神经系统疾病。通过基因工程方法改变脊髓灰质炎病毒的基因结构，获得弱化了的脊髓灰质炎病毒，用它研制成了小儿麻痹口服疫苗。通过基因工程方法制得脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3作为注射疫苗。1.3.3其他病毒性疾病疫苗1000010001001010Reportedcases195019551960196519701975Killed(Salk)vaccineTotalcasesSwedenandFinland流感疫苗流感病毒极易发生变异,能逃避抗体的作用。所以长期未有有效的疫苗面市。1993年Ulmer首先将流感病毒高度保守的NP基因插入质粒中制成核酸疫苗免疫小鼠，并取得了令人满意的效果。流感病毒狂犬病疫苗狂犬病疫苗是继天花之后，人类最早应用的第二个疫苗。狂犬病疫苗经历了脑组织细胞培养、基因工程、合成肽及抗独特型抗体疫苗等几个发展阶段。最近又发展了动物实验效果较好且更为安全的金丝雀痘病毒活疫苗。狂犬病毒疱疹病毒疫苗EB（Epstein-Barr）病毒是5种疱疹病毒之一。在非洲，这种病毒主要侵染B淋巴细胞引起波克梯氏淋巴瘤，在地中海地区及包括我国在内的亚洲地区则主要浸染口、咽上皮细胞引起鼻咽癌。现在已成功地构建EB病毒膜抗原的重组痘苗病毒，以及中国仓鼠表达系统，并完成了成人、儿童和幼儿的免疫观察。目前没有有效的疱疹病毒疫苗。疱疹病毒•霍乱疫苗接种已有100多年的历史，传统疫苗是采用肌肉注射的灭活或减毒霍乱弧菌菌体苗。效果不佳，副作用大（发热、头痛、腹泻），已被WHO宣布不再推荐此疫苗的应用。1.4.1霍乱弧菌疫苗1.4细菌性疾病的疫苗•根据霍乱弧菌的致病机理，科学家们利用基因工程技术研制了重组B亚单位疫苗，是已被WHO推荐应用的疫苗。•我国军事医学科学院生物工程研究所经过十多年的研究研制出了国家一类新药口服胶囊型重组B亚单位/菌体霍乱疫苗，并已上市。•幽门螺杆菌的灭活全细胞或经超声波破碎后的无细胞提取物均具有一定的免疫原性。•1995年Lee等人报道用幽门螺杆菌的尿素酶及大肠杆菌不耐热肠毒素为佐剂免疫小鼠，可产生保护性抗体。1.4.2幽门螺杆菌疫苗目前疟原虫的基因工程疫苗有抗子孢子疫苗，如CSP蛋白质；抗裂殖子疫苗；抗配子母细胞疫苗等。1.5寄生虫病疫苗1.5.1疟原虫疫苗1.5.2血吸虫疫苗血吸虫基因工程疫苗主要有两大类：一类是虫体蛋白质，如28kDa蛋白和25kDa蛋白的基因工程疫苗就具有良好的抗原性；另一类是酶性抗原，如谷胱甘肽S-巯基转移酶（GST）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、磷酸葡萄糖同分异构酶（TPI）等候选抗原。•DNA疫苗是利用克隆于载体上的抗原基因直接注射机体（包括皮下、皮内或肌肉等）、口服、鼻内滴注、鼻腔喷雾及阴道接种等方式，被细胞摄取并在细胞内表达相应的抗原，通过不同途径诱导机体的特异免疫应答。•DNA疫苗的最大优点易于制备、便于保存、基因在细胞的持续表达可达到持续免疫的效果并且易于制成多联多价疫苗。•缺点是DNA是否会整合到染色体上而引起严重的后果，是否会引起免疫病理作用，如诱发自身抗核抗体，是否会产生免疫耐受等问题仍有待研究与观察。1.6DNA疫苗（尚未广泛应用）•所谓治疗性疫苗是指有别于传统的对传染病有预防作用的疫苗，而是指具有积极治疗意义的一类新型疫苗。•预防性疫苗主要针对健康的人群，目的是预防，所以其普遍性、安全性和有效性是非常重要的，因此靶抗原主要以病原体或其自身的组成成分为主；而治疗性疫苗则是针对少数感染或患病个体，目的是治疗，因此它注重的是个体的病理学特殊性，针对性较强，靶位的选择趋于特殊性。1.7治疗性疫苗•非特异性疫苗是指具有增强肌体免疫系统的活性的疫苗。如病毒性疾病（如丙型肝炎、乙型肝炎、艾滋病等）的治疗性疫苗以及肿瘤疫苗。•特异性疫苗则是指用于治疗某一特定疾病的疫苗。如自身免疫性疾病疫苗，如多角性硬化病、系统性红斑狼疮等；心血管疾病疫苗，如动脉粥样硬化和高血压；认知性疾病，如朊病毒疾病、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病等。1生物技术与疫苗2生物技术与疾病诊断3生物技术与生物制药主要内容1生物技术与疫苗2生物技术与疾病诊断3生物技术与生物制药主要内容ELISA：酶联免疫吸附检测技术(enzymelinkedimmunosorbentassay)2.1.1ELISA技术的原理2.1ELISA技术与单克隆抗体2生物技术与疾病诊断测定抗体的测定抗原的间接ELISA法双抗体夹心法底物显色产物酶AbⅡAbⅠAg2.1.2常用ELISA诊断技术ELISA检验必须首先制备大量的抗原传统的抗原制备方法本身存在很大的危险，因为制造抗原时，要大量培养病原体，如果这些病原体逸出，将会造成很大危害；其次，产品的质量难以控制，难以标准化，从而导致各批次产品质量的差异；再次，生产费用高，特别是那些体外不能培养的病原体更是如此。基因工程抗原可以克服上述的不足。2.1.3基因工程抗原多克隆抗体由于一个抗原往往会有多个抗原决定簇，直接免疫动物后，从被免疫的动物的血清制备的抗体是一种含有可分别与多个抗原决定簇结合的多种抗体的混合物，这种混合物称之为多克隆抗体。2.1.4多克隆抗体与单克隆抗体单克隆抗体利用细胞融合技术，在体外大量培养融合细胞，由融合细胞产生大量的抗体。单克隆抗体只识别某一特定的抗原决定簇，所以它具有特异性强、成分均一、灵敏度高、产量大、容易标准化生产等优点而明显优于多克隆抗体。1978年Kan和Dozy首先应用羊水细胞DNA限制性片段长度多态性（RFLP）做镰状细胞贫血症的产前诊断，从而开创了DNA诊断的新技术。20多年来，DNA诊断技术取得了飞速的发展，建立了多种多样的检测方法，这些检测方法可以用于遗传性疾病、肿瘤、传染性疾病等多种疾病的诊断。2.2DNA诊断技术2.2.1DNA探针杂交技术PCR:polymerasechainreaction，即聚合酶链式反应技术是一项体外扩增特异DNA片段的技术。特点：灵敏度极高，可以检测极微量的病原体。但如果操作不当很容易产生假阳性反应。2.2.2PCR技术利用PCR诊断遗传病遗传病的诊断包括：•临症诊断（symptomaticdiagnosis）：是指遗传病出现临床症状后所做的诊断。•症状前诊断（presymptomaticdiagnosis）：是指临床症状出现前所做的诊断。•产前诊断：胎儿出生前所做的诊断。由于目前大多数遗传病无有效的治疗方法，因此产前诊断对于降低遗传病的发病率，提高人口素质具有重要的意义。•夫妇之一有染色体畸变。•35岁以上的高龄产妇。•夫妇之一有开放性神经管畸形。•夫妇之一有先天性代谢缺陷。•X-连锁遗传病基因携带者孕妇。•有原因不明的习惯性流产的孕妇。•羊水过多的孕妇。•夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇。•具有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。需要进行产前诊断的对象可利用PCR技术诊断的部分传染因子病毒细菌寄生虫单纯性疱疹病毒大肠杆菌衣原体肝炎病毒沙门氏菌锥虫巨细胞病毒耶尔森氏菌丝虫腺病毒分支杆菌疟原虫风疹病毒弯曲菌血吸虫Epstein-Barr病毒军团菌利什曼原虫轮状病毒博代氏杆菌旋毛虫乳头状瘤病毒弧菌小泰氏梨浆虫人免疫缺陷病毒链球菌弓形虫细小病毒葡萄球菌鼻病毒淋病奈瑟氏菌立克次氏体支原菌利用PCR诊断传染病限制性片段长度多态性（RFLP）是指由于碱基的改变导致DNA上的某一限制性内切核酸酶水解位点增加或减少。当这种DNA用内切酶水解时，产生的DNA片段数将相应的增加或减少，并且其DNA片段的分子质量也发生相应的改变，这种DNA片段的变化就称为限制性片段长度多态性。2.2.3PCR-RFLP技术RFLP：restrictionfragmentlengthpoly-morphism,限制性片段长度多态性。该方法是PCR