产品微生物检测作业指导书

所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次1/111.目的为产品的微生物检测提供具体作业依据。2.适应范围适应于本集团原材料、辅料、半成品、成品过程的微生物检测。3.职责由质量部负责制定、品管部实施,其它部门配合。4.工作程序4.1检验频次和方法同《初始污染菌检测作业指导书》4.1、4.2。4.2实施检测4.2.1接种生理盐水样液,在超净工作台中用无菌方法打开样品,从中随机称取10g样品,用灭菌剪刀剪碎后加入到100ml灭菌生理盐水溶液中,于漩涡混合器中振荡2min(2800次/min),每一种样品取30g,分别接种3管生理盐水样液。待上述样液自然沉降后取上清液作菌落计数，共接种6个皿每个平皿加入1ml样液，后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂15ml倒入平皿内，混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿于30-35℃培养3—7D后，计算平板上的菌落数，当平板上的菌落数超过300时，应稀释复测后再计数。4.2.2大肠杆菌检测方法标准作业规程标准要求1）接种乳糖胆盐发酵管阳性（黄色）（紫色）阴性2）接种到伊红美蓝平板黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐3）镜检革兰氏阴性杆菌（红色）拟制审核批准二、如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼脂平板，置35℃±2℃培养18～24h，观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。三、取疑似大肠菌落1～2个作革兰氏染色镜检，镜检为革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌取样液5mL接种50mL乳糖胆盐发酵管，置35℃±2℃培养24h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次2/11标准作业规程标准要求4）接种乳糖发酵管阳性（产气）5）结果判定伊红美蓝平板上有典型大肠4.2.3绿脓杆菌检测方法标准图示标准要求1）增菌培养液常呈黄绿色或蓝绿色拟制审核批准取样液5mL，加入到50mLSCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处挑取培养物，五、结果判定：凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，可报告被检样品检出大肠杆菌。G-无芽胞杆菌乳糖胆盐发酵管产酸产气乳糖发酵管产气取疑似大肠菌落接种乳糖发酵管，置35℃±2℃培养24h，观察产气情况。产气为阳性,不产气为阴性.所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次3/11标准作业规程标准要求2)划线接种十六烷三甲基溴化铵菌落扁平，边缘不整,略带粉红色3)革兰氏染色革兰氏阴性杆菌4)氧化酶试验阳性：红色或紫红色阴性：无色5)绿脓菌素试验拟制审核批准取可疑菌落涂片作革兰氏染色，如镜检为革兰氏染色为阳性杆菌，可初步判为非绿脓杆菌，如镜检为革兰氏阴性杆菌应进行下列试验从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，置35℃±2℃培养18～24h，观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不长。取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基对苯二胺试液，30s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色者为阴性。取2～3个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面，35℃±2℃培养24h，加入三氯甲烷3～5mL，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待三氯甲烷呈蓝色时，用吸管移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在。所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次4/11标准作业规程标准要求6)硝酸盐还原产气试验7)明胶液化试验阴性(凝固)阳性(液态)8)42℃生长试验(生长)阳性阴性(不生长)5）结果判定G-杆菌氧化酶阳性绿脓菌素阳性硝酸盐还原产气明胶液化42℃生长拟制审核批准取可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置35℃±2℃培养24h，取出放于4～10℃，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性。被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。挑取被检菌纯培养物接种在硝酸盐胨水培养基中，置35℃±2℃培养24h，培养基小倒管中有气者即为阳性。取可疑培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置42℃培养24～48h，有绿脓杆菌生长为阳性。所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次5/114.2.4金黄色葡萄球菌检测方法标准作业规程标准要求1）金黄色葡萄球菌在普通琼脂平板上2）在SCDLP培养液中增菌3）血琼脂培养基上划线金黄色,圆形,不透明,周围有溶血圈4）镜检革兰氏阳性球菌(紫色)5）甘露醇发酵试验阴性(紫色)(黄色)阳性拟制审核批准取上述菌落接种甘露醇培养液，置35℃±2℃培养24h，发酵甘露醇产酸者为阳性(黄色)。取样液5mL，加入到50mLSCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养24h。挑取典型菌落，涂片作革兰氏染色镜检，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，无芽胞与荚膜,镜检符合上述情况，应进行下列试验：从上述增菌液中取1～2接种环，划线接种在血琼脂培养基上，置35℃±2℃培养24～48h。在血琼脂平板上该菌菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次6/11标准作业规程标准要求6）血浆凝固酶试验阳性(凝固)(液体)阴性7）结果判定典型菌落G+葡萄球菌发酵甘露醇产酸血浆凝固酶阳性4.2.5溶血性链球菌检测方法标准作业规程标准要求1）增菌2）接种到血琼脂平板上灰白色,平板上有溶血圈拟制审核批准将培养物划线接种血琼脂平板，35℃±2℃培养24h观察菌落特征。溶血性链球菌在血平板上为灰白色，半透明或不透明，针尖状突起，表面光滑，边缘整齐，周围有无色透明溶血圈。凡在琼脂平板上有可疑菌落生长，镜检为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。取样液5mL加入到50mL葡萄糖肉汤，35℃±2℃培养24h。血浆凝固酶试验：玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，5min如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固则为阳性，如两者均无凝固则为阴性。凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验；试管法：吸取1∶4新鲜血浆0.5mL，放灭菌小试管中，加入等量待检菌24h肉汤培养物0.5mL。混匀，放35℃±2℃温箱或水浴中，每半小时观察一次，24h之内呈现凝块即为阳性（使试管倒置或倾斜时不流动为阳性）。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5mL作阳性与阴性对照。所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次7/11标准作业规程标准要求3)镜检革兰氏阳性链球菌(紫色)4）链激酶试验凝块(阳性)5）杆菌肽敏感试验阳性(抑菌圈)6）结果判定G+链状球菌血平板上有溶血圈链激酶阳性杆菌肽试验阳性拟制审核批准将被检菌菌液涂于血平板上，用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平板表面上，同时以已知阳性菌株作对照，在35℃±2℃下放置18～24h，有抑菌带者为阳性。吸取草酸钾血浆0.2mL(0.01g草酸钾加5mL兔血浆混匀，经离心沉淀，吸取上清液)，加入0.8mL灭菌生理盐水，混匀后再加入待检菌24h肉汤培养物0.5mL和0.25％氯化钙0.25mL，混匀，放35℃±2℃水浴中，2min观察一次(一般10min内可凝固)，待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2h内不溶化，继续放置24h观察，如凝块全部溶化为阳性，24h仍不溶化为阴性。镜检革兰氏阳性链状排列球菌，血平板上呈现溶血圈，链激酶和杆菌肽试验阳性，可报告被检样品检出溶血性链球菌。挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检，应为革兰氏阳性，呈链状排列的球菌。镜检符合上述情况，应进行下列试验：所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次8/115.革兰氏染色革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤:染色步骤染色原理5.1革兰氏染色具体操作方法是标准作业规程标准要求1)准备工作2）涂片接种环灭菌→挑一环纯水→涂在干净的玻片上→接种环灭菌→挑一个菌落→菌液与纯水混匀3）固定拟制审核批准试验前先准备革兰氏染色用的结晶紫染色液、革兰氏碘液、95％乙醇、沙黄复染液、酒精灯、接种针和水固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层上方尽快的来回通过3—4次，共约2—3秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃）,放置待冷后，进行染色。所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次9/11标准作业规程标准要求4)结晶紫初染5）自来水或纯水冲洗6）革兰氏碘液7）自来水或纯水冲洗8）酒精脱色拟制审核批准取2～3滴结晶紫染色液，滴在固定了的细菌覆盖涂面，染1分钟。吸取95%的乙醇从上往下把把多余的染料冲洗掉，直到染料不能再被冲洗掉为止，被菌体吸附的染料则保留。立即用水把乙醇冲掉,用吸水纸吸去多余的液体或甩干.结晶紫染1分钟后，用细小的水流从上往下把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。用吸水纸吸去多余的液体后(或甩干)，滴加2～3滴革兰氏碘液，覆盖涂面染1分钟。革兰氏碘液染1分钟后，用细小的水流从上往下把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。所有打印文件如未经文控中心统一分发并加盖“受控”印章，均为无效文件！WN-DC-P01-R03A稳健医疗集团有限公司产品微生物检测作业指导书文件编号WN-QM-P28-SOP03版次A/0生效日期2009-9-29页次10/11标准作业规程标准要求9）沙黄复染10)自来水或纯水冲洗11)干燥12）镜检5.2革兰