第五章-环境毒理学常用实验方法

第五章环境毒理学常用实验方法回顾•第一节、环境污染物的毒作用–基本概念：毒物，毒性，中毒，危险性和危害性，剂量，效应和反应，剂量-效应和反应关系（掌握）–剂量：绝对致死量（LD100），半数致死量（LD50），最小致死量（MLD），最大耐受量（MTD）、半数效应剂量（ED50）、最小有作用剂量、最大无作用剂量（掌握）–毒作用类型（了解）–联合作用（掌握）–生物毒素：黄花菜，蘑菇（了解）•第二节、影响毒作用因素–毒物因素、机体因素、环境因素、接触条件（掌握）2Outline•实验基础•急性毒性实验•蓄积性毒性实验•亚慢性和慢性毒性实验3环境毒理学实验基础4实验动物•经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学研究的动物。温血动物•兔、豚鼠、大鼠、小鼠•有时也用猴、狗、猫等实验动物的选择5小鼠大鼠家兔豚鼠仓鼠实验动物的选择种属的选择个体选择年龄体重性别生理状态健康状况10实验动物的选择种属的选择•机体反应上尽量近似于人体；•易获得、易饲养、易管理；•最敏感、最合适；•选用几种不同种属的动物(对毒作用不清楚的化学物质)；•借助已有毒理学研究资料选择。11实验动物的选择借助已有毒理学研究资料选择•气体、蒸气对粘膜的刺激作用——猫•毒物对皮肤的局部作用——豚鼠或兔(皮肤对刺激物的反应近似于人)•过敏性反应——豚鼠(易于致敏)•观察致呕吐作用的实验研究——狗、猫•外界环境因素引起机体体温过高及体温过低的反应——兔或猫(大鼠、小鼠对于体温调节不稳定)•高血压病理——狗、兔、大鼠(易出现血压变化)•物质的致癌作用——小鼠和大鼠•慢性中毒损害实质性脏器的毒物——小鼠(实质性脏器容易罹患病变)12个体选择•年龄除特殊要求外，动物年龄一般选用初成年者。•性别根据目的，若对动物性别无特殊要求，宜选用雌雄各半。•生理状态——怀孕、哺乳通常实验均不宜采用处于特殊生理状态的动物进行，为了某种特定的实验目的除外。•健康状况所用动物进入实验室后，于实验开始前应观察一周以上，以删除不健康的动物，并使实验动物适应环境。实验动物的选择13动物模型选择的依据：动物模型对于一定环境因子的反应尽可能与目标生物的反应相近;具有经济可行性。实验动物的毒理学实验资料外推到人群接触的安全性的不确定性实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同，有时甚至存在着质的差别高剂量向低剂量外推的不确定性小数量实验动物到大量人群外推的不确定性成年健康动物向年老体弱及患病个体外推的不确定性14常用染毒途径和方式（1）经口灌胃、喂饲、吞咽胶囊（2）经呼吸道动物自行吸收（静式吸入染毒、动式吸入染毒）人工动物气管注入（3）经皮肤（4）其它途径注射途径15常用染毒途径和方式(1)经口染毒①灌胃用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内；直接灌入胃内，不与口腔及食道接触；给予的化学物剂量准确。②喂饲将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物自行摄入含化学物的饲料或水，然后依每日食入的饲料与水再推算动物实际摄入化学物的剂量。16(1)经口染毒优缺点优点：接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水的方式，方法简便、易操作。缺点进食时浪费、损失饲料多，摄入的量不准确；如果化学物有异味，动物可能拒食；如果化学物在室温下可以挥发，或在饲料中和水中可以水解，则剂量也不准确；有经呼吸道与皮肤交叉吸收的可能；更适宜进行多日染毒，急性毒性试验一般不用之。17③吞咽胶囊将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放到动物的舌后咽部迫使其咽下。此法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异臭的化学物。兔、猫及狗等较大动物可用此法。18凡是气态或易挥发的液态化学物均有经呼吸道吸入的可能，在生产过程中形成气溶胶的化学物也可经呼吸道吸入。类型:动物自行吸收静式吸入染毒动式吸入染毒人工动物气管注入人工动物气管注入——将液态或固态外源化学物注入肺内。这是一个手术过程，仅适用于制造化学物对肺脏损伤模型的制备，而不用于一般毒性研究。（2）经呼吸道染毒19•静式吸入染毒在一定容积的染毒柜内加入一定量受试物，造成含一定浓度受试物的空气环境，使受试动物在规定时间内,经吸入而达到染毒，适用于短时间染毒的试验。•动式吸入染毒采用机械通风为动力，连续不断地将含有已知浓度受试物的新鲜空气送入染毒柜内，并排出等量的污染气体，使染毒浓度保持相对稳定，这样可使染毒时间不受染毒柜(室)容积的限制，也可避免动物缺氧、CO2积聚、温度增加等对试验结果的可能影响，适用于较长时间以及反复染毒的试验使用。20图8-3动式染毒柜装置示意图21液态、气态和粉尘状外源化学物均有接触皮肤的机会。能经皮肤吸收的化学物主要以扩散方式经过皮肤角质层屏障，在表皮角质细胞的间质中充满非极性的脂类物质。脂溶性化学物主要通过这种途径渗透入皮肤，角质层薄的皮肤部位更易吸收。（3）经皮肤染毒22•实验前详细检查去毛部位皮肤有无擦伤、红肿、皮疹等异常现象，剔除不合格动物。•染毒时按单位体重确定给予所需毒剂的容量。•接触时间应与人实际接触该物质的时间相仿。•成年动物——年老动物表皮厚度、细胞成分改变•为保证不因皮肤部位不同而形成的化学物渗透率差异，一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮肤。面积则依据选用动物及受试物的剂量和剂型而定。（如家兔可取5cm×6cm、豚鼠取3cm×4cm、大鼠取1.5cm～2.0cm直径的面积，小鼠取1.0cm～1.5cm直径的面积。）23有时需对外源化学物进行绝对毒性或比较毒性研究，或进行一些必要的特殊研究(如静脉注射毒物动力学、代谢研究、急救药物筛选等)，往往用注射途径染毒。静脉注射:大鼠、小鼠尾静脉，兔耳缘静脉注射途径肌肉注射皮下注射腹腔注射:小动物（4）其它途径染毒24动物实验残酷的动物实验2526动物实验目的1科学研究：探测未知，发现新知识。2常规检测：药品、化妆品和家居用品的毒性。3教学实验：验证知识，练习操作。271科学研究动物主要用于生物医学和心理学的实验，如疾病的认知和模型，药物的作用和毒性，新的医疗或手术开发。动物实验为现代医学的发展做出了很大贡献，因此而牺牲的动物数量和造成的动物痛苦也是无法估量的。如今科学研究不仅成为攫取名利和谋生的工具，大量的研究和动物实验又是微不足道或者毫无意义的，甚至有些研究设计就不是为了产生重要的有益结果，动物也成为无谓的牺牲品。所以，大量的动物的遭受折磨和痛苦是完全不必要的。28医学上的动物实验各种医学杂志上大量的实验报告所采用的动物实验的方法有：加速、攻击、窒息、致盲、烧灼、离心、挤压、震荡、拥挤、砸碎、药物试验、实验性神经症、冷冻、加热、出血、击打后腿、制动、隔离、复合伤、捕杀、蛋白质缺乏、惩罚、照射、饥饿、休克、脊髓损伤、应激或压力和干渴，还有很多。引自彼得·辛格《动物解放》的确方法“还有很多”…例如实验感染和中毒就是另外最常见的二大类。29动物实验的残酷性在于，不仅动物几乎全都被处死，而且造成很多动物极为严重乃至难以忍受的躯体和精神上的急性或慢性折磨和痛苦。303132颅内插管→后肢砸伤↘33癌肿→342检试刺激性兔眼刺激试验Draizetest35363教学373839全世界每年用多少实验动物？难以准确估计英国废除活体解剖联盟(BUAV)估计：脊椎动物约为1亿，欧盟1000~1100万。纳菲尔德生命伦理委员会估计：全世界约为5000万~1亿。40美国每年用多少实验动物？•2005年农业部统计共计为120万，但不包括大鼠和小鼠。后者是大头，约占90%。•1995年塔夫茨大学研究：1992年总共用实验动物1400~2200万。1970年为5000万。•1986年，美国国会技术评估委员会报告：每年1000万~1亿，最佳估计值至少在1700~2200万。412005年欧洲使用的实验动物的构成（共计1210万）42我国的动物实验的问题1科研经费增长，晋升制度缺陷，论文数量居世界前列，动物实验大量增加。2大量招收学位研究生，博士培养数量已跃居世界第一。生物医学的研究生大都依靠动物实验完成学位论文。3粗放。数量大，但有科学意义的少，无意义的重复多，创新极其罕见。4缺乏任何实质性的审查监督的手续、组织和制度。5“与动物实验密切相关的不仅有论文发表和职务晋升，而且还能获奖和得到新项目的经费。”43动物有感情吗？•动物和我们一样也很重感情，它们也能感受到爱、恐惧、伤心和愤怒。所有的动物都是有感情的，只是他们的表达方式不太一样。要不人为什么老说。人是最最懂感情的动物？•请举例说明身边动物有感情的例子？44感人一幕村里两只白鸭结伴出行，不想其中一只被车轧死，另外一只白鸭守在同伴尸体一旁30分钟，无论谁想上前，它都准备去叨人，不许生人靠近。城市晚报（长春），2013年08月21日45黄狗撩水救鱼：鼻子舀水泼向奄奄一息的鱼身上15年4月22日，北京女孩诸柔萌(音)在微博上晒与170斤宠物猪同吃同眠狗的报恩！女子公园遇4歹徒流浪犬救她一命第一节急性毒性试验一、急性毒性的概念急性毒性是指机体(人或实验动物)一次或24h之内多次接触(染毒)外源化学物之后，在短期内所发生的毒性效应，包括引起死亡效应。一次：瞬间染毒，如经口染毒、经注射途径染毒，但在经呼吸道与经皮肤染毒，则是指在一个特定的期间内持续地接触化学物的过程，“一次”含有时间因素。多次：当外源化学物毒性过低，或一次染毒剂量受机体容量限制，需给予实验动物较大剂量时，则可在24h内分次染毒。53二、急性毒性试验的目的探求化学物的致死剂量，以初步评估其对人类的可能毒害的危险性；求该化学物的剂量-反应关系，为其它毒性实验打下选择染毒剂量的基础。表示急性毒性大小：LD5054（1）急性毒性测定确定一次染毒的LD50或LC50；（2）经皮肤染毒实验考察受检化学物质能否经皮肤进入体内，LD50；（3）局部作用实验通过使受检化学物质直接接触皮肤及眼结膜等试验，研究其对生物体局部有无刺激、腐蚀及其他危害作用。三、急性毒性试验的内容55（4）中毒症状的观察据染毒动物症状及体征，粗略了解毒物作用的程度和可能作用部位。（5）功能及病理组织学检查选择必要的功能指标，寻求毒作用剂量与功能改变的关系，确定急性阈剂量；通过病理组织学检查，进一步了解毒作用部位及毒害程度。56第二节、蓄积毒性实验蓄积毒性作用–低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次地与机体持续接触，经一定时间后使机体出现明显的中毒表现。–进入速度机体消除速度—不断累积—毒性作用阈剂量57蓄积毒性实验蓄积毒性作用环境污染物在体内的蓄积作用的过程，表现为：•物质蓄积：污染物不断进入机体，其吸收量排出量，以致在体内的贮留量增多；•功能蓄积：不断进入机体内的环境污染物，反复作用机体，引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最后导致出现损害作用。•相对的区分，同时存在，互为基础58蓄积毒性实验蓄积毒性作用•环境污染物在体内的蓄积作用，是引起亚慢性和慢性毒性作用的基础。•常是评估环境污染物毒性作用的指标之一；•制定其在环境中的卫生标准的重要参考依据。•阐明污染物有无蓄积作用及其程度有重要意义。59蓄积毒性实验一、试验方法（一）蓄积系数法固定剂量每天连续染毒法剂量定期递增染毒法（二）20天蓄积试验法（三）生物半减期法60（一）蓄积系数法（cumulativecoefficientmethod）分次给受试物后引起50%受试动物出现某种毒效应的总剂量（∑LD50(n)表示）与一次给受试物后引起50%受试动物出现同一毒效应的剂量（以∑LD50(1)表示）的比值，即一、试验方法)1(50)(50LDLDKn蓄积系数（K）蓄积作用强度1高度蓄积1-3明显蓄积3-5中毒蓄积5轻度蓄积蓄积作用强度分级61（二）20天蓄积试验法•实验处理–实验动物：大鼠或小鼠–按LD50的1/20、1/10、1/5、l/2及0(溶剂对照)随机分成5组，每个剂量组雌雄动物各10只–每天对动物进行染毒1次，连续20天，各组总剂量分别为1LD50、2LD50、4LD50、10LD50。–观察停药后7天内的死亡情况。•结果评价–若1/20LD50组