您好,欢迎访问三七文档
兔病毒性出血症综述武永淑(82101105080):病原李巧玲(82101102463):流行病学王泽祥(82101105078):诊断孙宏勇(82101102472):疫苗摘要:由于兔病毒性出血症给中国及欧洲、美洲、澳大利亚的养兔业造成巨大的威胁,随着对兔出血热病毒的研究不断深入,对该病不断获得新的认识,在此,通过病原、流行病学、诊断方法、疫苗研究等方面,概括其研究进展。关键词:兔病毒性出血症;RHDV;诊断;疫苗兔病毒性出血症(Rabbitviralhemorr-hagicdisease,RHD)俗称兔瘟,是由兔病毒性出血症病毒引起的兔的一种急性、高度接触性传染病,特征为呼吸系统出血、肝坏死、实质脏器水肿、淤血、出血变化。本病于1984年在我国的江苏省的江阴县首先被发现,随后迅速蔓延至全国25个省、市、自治区。迄今,亚洲的朝鲜、印度、美洲的墨西哥、欧洲的奥地利、比利时、波兰、丹麦、德国、法国等国也都有发生。本病呈爆发性流行,发病率及致死率极高,对养兔业造成极大的经济损失。1病原兔病毒出血性病毒(RHDV),属于杯状病毒科,兔病毒属。病毒粒子没有囊膜,直径35-nm,二十面体对称,表面有32个杯状凹陷。在氯化铯的浮密度为1.36-1.38g/cm3,沉降系数162S。RHDV基因组为单股正链RNA,长约7.437kb,分子质量为2.4×103-2.6×103,5’端没有帽子结构,而是与一个分子量为15kDa的蛋白质VPg共价结合,3’端有Poly(A)尾,Poly(A)结构与病毒的感染性无关[1]。基因组RNA有2个可读框(ORF1,ORF2),第1-9位碱基为5’端非翻译区(NTR)。最后59个碱基为3’端的NTR。ORF1位于基因组的第10-7044位碱基,编码一个含有2344个氨基酸的多聚蛋白,分子量约为257kDa。蛋白质水解是由病毒自身编码的3C样蛋白酶进行的,在基因组中3C样蛋白酶基因位于3D样RNA模板依赖性RNA聚合酶基因的上游。该多聚蛋白被水解形成一个主要的衣壳蛋白VP60,7个非结构蛋白,分别是P16、P23、P37、P29、P13、P58。结构蛋白和非结构蛋白在ORF1中的排列顺序:NH2-p16-p23-p37-p29-p13-p15-p58-p60。ORF2位于基因组的3’端,对应在第7025-7378位碱基,与ORF1的3’端有19个核苷酸重叠,编码蛋白质VP10,分子量约为12kDa,VP10是一种碱性蛋白。在成熟的病毒粒子中,VP10是RHDV衣壳中的一个小衣壳蛋白。在感染的组织和病毒粒子中,除了全长的基因组RNA外,还有一条长约2.2kb的亚基因组RNA(sgRNA),其5’端与基因组RNA一样,也与VPg蛋白共价结合,3’端有Poly(A)尾。基因组RNA与sgRNA在数量上是相等的,本别独自包装入病毒粒子中,至今未发现病毒粒子中含有两种RNA。2RHDV结构蛋白2.1VP60RHDV主要衣壳蛋白VP60来自两条途径:多聚蛋白的水解加工和sgRNA的翻译[2][3]。RHDV是由180个VP60亚单位以二聚体的形式构成,二聚体由VP60单体以A/B5和C/C2两种方式形成,单体在二聚体的构象有三种形式[4],这些蛋白质分子形成拱形双体结构,从而在病毒表面形成32个杯状凹陷。根据氨基酸的序列,可将VP60分为A(第1-21位)、B(第22-300位)、C(第301-328位)、D(第329-343位)、E(第344-434位)、F(第435-579位)6个区[4]。A、B、C、D四个变异区率较低,C、E两个区变异率较高。用电子显微镜结构进行分析[5],VP60折叠成两个结构紧凑的区域,N端约250个氨基酸残基形成了蛋白质的S结构域,其余的C端部分形成了蛋白质的P结构域,两个结构域通过柔性铰链连接,由此使病毒衣壳形成了两个功能不同的内、外同心结构。内壳由VP60的N端(S结构域)组成,包括A区和B区,用来保护和容纳基因组;VP60的C端(P结构域)组成,包括C、D、E、F区,P结构域又分为P1、P2两个结构域,P2位于病毒衣壳表面,编码着病毒的主要抗原表位,其变异性相对较高。2.2小衣壳蛋白小衣壳蛋白VP10由RHDV基因组RNA3’端的ORF2和sgRNA的ORF共同编码,在基因组中ORF2的翻译效率约只有ORF1的20%。ORF1的终止密码子对于VP10的蛋白表达很关键,VP10的翻译从位于ORF1的终止密码子上游3-5个碱基的AUG密码子开始,但在没有AUG起始密码子时VP10也可表达。只要翻译在规定的位置终止,缺少或替换ORF1的大部分序列对ORF2的表达没有明显影响,但ORF13’端的84个碱基序列对VP10的表达必不可少。与ORF1不同,ORF2的序列几乎全部用外源基因替换后也不影响其翻译,VP10的翻译终止/起始过程很特别,不依赖翻译起始密码子AUG,而是需要起始位点上游的一个序列成分[6]。3流行病学国外已有关于RHDV分子流行病学方面的研究报道。Gall等[7]曾对法国1993~2000年的104株RHDV分离株进行了系统发生树分析,其研究结果显示,RHDV不同分离株之间存在不同程度的变异现象,而且RHDV基因群的划分与毒株分离年份之间存在一定关系,推测RHDV有进一步变异的可能。Moss等[8]通过对英国1955~1964年保存的RHDV的回顾性调查分析发现,RHDV可能在整个欧洲已经流行了几个世纪,但是其又是如何从非致病性病毒演变为高致病性病毒,并突然在世界范围内爆发,至今尚是未解之迷。最近国内已有部分专家对于国内的RHDV流行毒株进行分析。朱金梅等[9]和刘月环等[10]和对于1989~2006年7株兔病毒性出血症病毒(RHDV)浙江分离株的核衣壳蛋白基因(VP60)进行了序列分析,并与国内外RHDV的基因组序列进行了比对和分析,国内的7株RHDV毒株氨基酸序列同源性较高,中国的RHDV与欧洲株有较近的亲缘关系,主要位于C亚群。4诊断根据临床症状和病理变化可以对RHD进行初诊,确诊需要实验室诊断。实验室诊断包括免疫学诊断方法和分子生物学诊断方法。免疫学方法包括血凝试验、血凝抑制试验、间接血凝试验、琼脂扩散试验(AGP)和ELISA实验。分子生物学方法主要是PCR及其衍生技术如RT—PCR。4.1血凝实验:RHDV对人、绵羊和鸡的红细胞有凝集作用,HA和HI可进行病毒鉴定和免疫学诊断,目前国内在兔群免疫测和试验兔等级检测中,最常用方法为HI。兔病毒性出血症病毒阳性血清按常规方法进行红细胞凝集抑制试验(HI),病料中病毒的血凝性若被该血清抑制,说明病料中的病毒为兔病毒性出血症病毒,可确诊为兔瘟。间接血凝试验其敏感性比HI高32倍。4.2琼脂扩散试验(AGP):用病死兔肝脏乳剂制备的冻融抗原对感染病毒的兔血清进行试验,检测到了抗体。4.3酶联免疫吸附法(ELISA):检测RHDV常的ELISA法有双抗体夹心法和间接EIISA,前用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体。王永山等(2004)用基因重组抗原建立了ELISA方法检测RHDV抗体并做了标准化,以大肠杆菌pET—VP60/BL21重组菌诱导表达提取物稀释被检血清以消除非特异性反应[11]。研制RHDV抗体酶联免疫检测试剂盒,测定其主要指标,制定各成分的质量控标准,为兔群进行免疫学监测及评价疫苗的免疫效果提供了便利。刘怀然等(2006)通过差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯RHDV病毒粒子作为包被抗原,优化反应时间和反应浓度,筛选试剂:8%马血清作为封闭液,3%马血清作为稀释液,建立间接ELISA检测方法,组装试剂盒[12]。试剂盒敏感性为血凝抑制试验的4~32倍,但比进口试剂盒低1~2个稀释度。对兔血清随机检测,与血凝抑制试验的复核率为95%。杨汉春等(1990)应用斑点酶联免疫吸附法(Dot—ELISA)检测兔出血症病毒抗体[13]。竞ELISA法用于不同来源的RHDV毒株抗原性的分析及对某株单抗是否可用于酶联试验进行筛选和鉴定,与实时荧光定量PCR检测方法相比较,不够敏感。4.4RT—PCR检测RHDV:RT—PCR广泛应用于遗传病的诊断,且可用于定量监测某种RNA的含量。Ros等(1997)采用RT—PCR检测方法,研究RHDV和欧洲棕色野兔综合症病毒(EBHSV)是否有本质的联系。收集病毒样本,扩增vp60基因组序列并测序,发现RHDV和EBHSV组间同源性为52.6%-60.0%[14]。Moss等(2002)从贮藏的1955年的健康兔和死兔的血清、肝脏和骨髓中提取RNA,采用RT—PCR,检测到RHDV并测定序列,这些序列仅仅是病毒衣壳蛋白基因的部分序列,与现在流行的RHDV强毒株序列十分相似,测序结果显示,RHDVRNA的高度稳定性。基于血清学和代表衣壳蛋白VP60部分基因的序列数据,暂鉴定出RHDV的8个系统发生群,显示这些病毒间重要的基因异源性。4.5免疫捕获RT—PCR检测RHDV:Le—Gall—Re—cule等(2001)以抗RHDV高免血清包被96孔ELISA板,加入匀浆处理后的感染兔肝脏悬液,37℃作用1h进行捕获,在ELISA孔中反转录,产物进行常规PCR[15]。这种运用免疫捕获RT—PCR的方法使病毒纯化、扩增,结合ELISA快速和RT—PCR法敏感的优势,比普通ELISA敏感10-100倍;与普通RT—PCR法相比,简化了样品制备。4.6DNA探针技术:Geimetti等以地高辛配基标记的RNA为探针,通过原位杂交来检测RHDV。用此方法检测RHDV比免疫组化法敏感性高。5基因工程疫苗的研究由于RHDV至今未能稳定地适应于任何细胞培养,现行疫苗只能用自然或人工感染RHDV致死的兔肝脾组织制备组织灭活苗,存在着诸多弊端。因此,应用现代生物技术研制RHDV基因工程疫苗是解决问题的重要途径。由于VP60在诱导宿主细胞免疫反应中起重要作用,是病毒免疫保护性抗原,因此,有关RHDV基因工程疫苗的研究均集中在VP60的表达和应用。迄今,国内外已克隆了许多RHDV毒株的VP60基因并在不同的表达系统中进行了表达,实验结果表明,不同的表达系统以及在同种表达系统中采用不同的表达方式对重组的VP60的表达量和抗原性都有影响。5.1原核表达系统早在1994年,Boga等(1994)[16]就将RHDV的VP60基因在大肠杆菌中进行了表达,与β-半乳糖胺酶融合表达的重组VP60虽然可诱导产生特异抗体,但是不能保护免疫兔抵抗RHDV(100LD50/兔)强毒的攻击,表明融合蛋白会严重影响重组VP60蛋白的免疫性质,重组VP60只有自然VP60只有自然VP60的部分抗原性,不能诱导机体产生保护性免疫应答[20]。而在T7RNA聚合酶的表达系统中表达的VP60,其免疫原性与病毒多肽相似,可是免疫兔获得保护。这表明,VP60非融合表达或在其N端加上少数的氨基酸残基时,重组VP60的抗原性无显著变化,能诱导机体产生有效的保护性免疫应答。王永山等(2004)[17]选用RHDV中国早期流行株NJ85,用pET-28载体在大肠杆菌中高效表达了VP60,表达量可达到40%。用重组VP60加免疫佐剂皮下免疫兔,14天后,兔血清ELISA抗体效价达到1:64000,该抗体水平可以保护实验兔抵抗RHDV强毒攻击。5.2杆状病毒-昆虫细胞表达系统Laurent等(1994)[18]和Nagesha等(1995)[19]先后用杆状病毒-昆虫表达系统表达了VP60,ELISA和免疫印迹证明表达产物具有RHDV抗原性。对感染细胞的培养上清液和纯化的蛋白质进行电镜检查可发现重组VP60自装配成VLP。VLP与抗RHDV的多克隆抗体、识别病毒构象表位的单克隆抗体均有免疫反应,表明VLP与天然病毒的形态和抗原性非常相似,经动物实验证明VLP能抵抗RHDV强毒攻击。Plana-Duran等(1996)将VP60基因分别置于杆状病毒的多角体和P10启动子控制下,在昆虫细胞进行表达,实验发现P10启动子控制的VP60蛋白表达量是多角体
本文标题:兔病毒性出血热综述
链接地址:https://www.777doc.com/doc-5040242 .html