动物细胞工程PPT

动物细胞工程应用龙江一中李启国动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用技术皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，10～14天后就要被身体排斥。如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？人耳鼠“人耳鼠”再出风头2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动——这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？一、动物细胞培养1.发展历史:20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。2、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.动物细胞的培养过程幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础剪碎组织的目的？胰蛋白酶处理的目的？有关概念•原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养）•传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液10代细胞50代细胞传代培养无限传代单个细胞加培养液（分解弹性纤维）原代培养胰蛋白酶剪碎细胞株细胞系动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。遗传物质未改变遗传物质已改变3、动物细胞培养过程：动物组织细胞培养要求一体外培养特点:大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。二、培养条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。•【讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。1）恒定的温度:37℃，•维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；•人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；•在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；•41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；•当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低2）PH：7.2-7.４•当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。用来检测PH的变化：红色--pH7.4，•橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。3)气体：•二氧化碳有调节PH的作用。•氧气为生物新陈代谢所必须•气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。4）营养—培养基：•在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物,促生长因子，微量元素及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。5)、无污染环境•培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。三.动物细胞培养技术的应用•蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体•健康细胞培养培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植•细胞的生理、药理、病理研究用于筛选抗癌药物植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白1、植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？２、动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的吗？３、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？４、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？没有是成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理。思考题６、细胞膜的主要成份是什么？７、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？８、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？蛋白质和磷脂能注意时间的控制思考题５、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成份是蛋白质９、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？１０、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？不能，因为两者的最适pH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适pH较接近胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛思考题11、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？12、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？13、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后继续增殖。这样的过程叫做传代培养思考题14、如何理解原代培养和传代培养？15、传代培养的细胞能一直传代下去吗？16、有些为何能一直传下去？17、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养不都能发生突变，朝着癌细胞方向发展不全是思考题18、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存10代以内的细胞，因为10－50部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展。细胞培养耗费大量物力、人力、财力，因此及时冻存细胞很有必要，通常情况下，10代以内的细胞可以冷冻保存，-70℃可以保存一年，或者保存于液氮中。复苏细胞应采用37度水浴快速复苏的方法。思考题19、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体一、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、动物细胞全能性的表现程度不同受精卵胚胎干细胞多能干细胞单能干细胞体细胞核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）2、动物体细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。3.培育过程去核卵细胞体细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎(或重组胚胎）胚胎移植母体子宫妊娠、出生个体4、原理动物体细胞核具有全能性卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞二.体细胞核移植技术的应用前景动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。其意义：1、有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育2、对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩群有重要意义3、降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率体细胞核移植技术存在的问题：克隆的成功率低许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞（）A．细胞系B．细胞株C．原代细胞D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是-----（）A.动物细胞融合B.单克隆抗体C.胚胎移植D.动物细胞培养AD3.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于----（）A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。A教学反馈小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势一、动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用动物细胞融合细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核细胞融合与融合诱导细胞融合物质诱导剂：仙台病毒聚乙二醇电融合诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。二、单克隆抗体什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。B淋巴细胞与抗体１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。２．动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。３．每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高如何大量生产单克隆抗体？•利用淋巴细胞产生抗体的功能•利用肿瘤细胞无限增殖的特性•利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞•利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体单克隆抗体的应用与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：1、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤资料：目前世界各国已经研制出数以百