6-Waters-HPLC色谱柱介绍

如何选择理想的HPLC分析柱HPLC分析柱王峰Waters应用部©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation1Waters应用部色谱分析方法开发色谱分析方法开发ƒ方法开发：影响分离选择性主要因素三角形关系ƒ方法开发：影响分离选择性主要因素——三角形关系溶剂类型乙腈or甲醇等pH酸or碱α选择性方法优化等度或梯度精细梯度调整方法优化温度流速色谱柱类型苯基等流速©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation2C18，C8，苯基等严格的药物质量控制对色谱柱性能的要求和色谱柱选择方案谱柱选择方案ƒ市场上有如此之多的C18柱（药典：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂）ƒ它们的性能都相似吗？ƒ我如何选择？峰形不佳对积分准确度的影响拖尾因子=1.00积分后定量结果拖尾因子=1.58峰形不佳对积分准确度的影响99.6%99.8%99.9%积分后定量结果923%95.3%积分后定量结果97.8%99.6%92.3%©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation3选择性差异来源为什么这些硅胶反相C18填料如此不同？ƒ色谱实验结果揭示：疏水性不同—疏水性不同—残留硅羟基活性不同—填料基质不同填料基质不同ƒ为什么？—不同C18配体键合水平（状况）o配体覆盖率—不同硅胶颗粒基质密度表面积孔径o密度，表面积，孔径o纯度©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation4Waters色谱柱平台：Waters色谱柱平台：设计优化于pH稳定性设计优化于选择性pH稳定性市场上MS兼容性昀好的色谱柱选择性多样性填料基质解决不同的的分离问题©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation51.7 [UPLC],  2.5, 3.5, 5 and 10 µm1.8 [UPLC], 2.5, 3.5 and 5 µm HSS1.7 [UPLC], 2.5, 3.5 and 5 µm CSH高纯硅胶系列色谱柱高纯硅胶系列色谱柱常规应用常规应用常规应用常规应用©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation6高性能的保证：高纯硅胶填料高性能的保证：高纯硅胶填料传统型传统型C18C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响对羟传统型传统型C18C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响流动相pH7羟基苯甲酸丁H3CH萘丁酯CH3N+二氢苊阿米替林TfUSP=6.5©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation7MinutesMinutes515253545键合相硅胶基质填料键合相硅胶基质填料Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)键合相(配体)：C18端基封口基团残留硅羟基合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体（键合相）3.端基封口©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation8硅胶基质碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理与键合相的疏水性作用双重保留机理:1)与键合相的的疏水性作用;与键合相的疏水性作用1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiOSiO-SiO-SiO-SiO-O-SiO-SiO-OSiOHO-SiO-SiOHOSi(CH)HN+(CH3)2HN+离子交换作用O-SiO-O-SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiO-SiO(CH3)2HN2当流动相pH值小于3时,硅醇基呈中性(未解离)当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离)O-SiO-O--SiO-SiOHO-SiO-Si(未解离)性(大部解离)BaseBase对碱性化合物的保留及©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation9物的保留及严重拖尾碱性分析物在硅胶柱上的拖尾解决办法碱性分析物在硅胶柱上的拖尾解决办法ƒ提高Ｃ的键合密度—减少游离硅羟基增加样品容量—增加样品容量—增加保留—提高分离度提高分离度ƒ良好的端基封尾—屏蔽游离硅羟基ƒ改性填料和键合相ƒ调整pH值尝试离交换离对色谱方法ƒ尝试离子交换和离子对色谱方法©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation10WatersShield技术：内嵌极性配体的C18色谱填料内嵌极性配体的C18色谱填料C18内嵌极性基团（氨基甲酸酯）键合相传统C18键合相©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation11内嵌极性基团固定相：分离机理分离机理H3CH极性基团增加了表面层水的浓度水“屏蔽”CH3N+水“屏蔽”层ƒ改善与水的浸润性－100%水溶液兼容降低了碱性化合物的保留屏蔽了带负©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation12ƒ降低了碱性化合物的保留ƒ降低了拖尾现象电的硅羟基高纯硅胶基质：内嵌极性基团的配体与直链烷烃配体的比较ƒ减少了拖尾，降低碱性物质的保留SymmetryShield™RP18TFUSP=1.1阿米替林ƒ改变了分离选择性阿米替林S®CSymmetry®C18TFUSP=1.9Minutes0102030©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation13分析方法pH的限制分析方法pH的限制硅胶材料的pH使用极限高pH聚合物基质柱低pH硅胶柱中间pH硅胶柱©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation14123456789101112低pH，硅胶表面键合相的水解MonofunctionalLigandg+SiCCCCCCCCH3CHH3CClOHSiOOOCH3OCCCCH3C+HClSiCCCCCCCCH3CH3OSiOOLowpH(hydrolysisofligand)OOHC+SiCCCCCCCCH3CH3H3CHOOHSiOOO©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation15Note:Sometimescalled“ColumnBleed”3O高pH，硅胶基质溶解亲核反应•CompletedissolutionofSilicaofSilica•Catastrophiccolumnfailure•Shortlifetimes©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation16杂化硅胶系列色谱柱杂化硅胶系列色谱柱宽宽pHpH范围应用范围应用宽宽pHpH范围应用范围应用©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation17分析方法pH的突破ƒ宽pH范围112ƒ宽pH范围：1-12ƒ良好色谱峰形ƒ高稳定性高稳定性©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation18123456789101112高pH耐受性对碱性化合物的分析特别有利—分离选择性方法耐受性与柱使用寿命分离选择性、方法耐受性与柱使用寿命©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation19增加化合物的保留并提高灵敏度：增加化合物的保留并提高灵敏度：高pH2高pH0.1%NH4OH5310-羟基吗啡%51346吗啡-3β-D-葡萄糖醛苷吗啡0.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.800Compounds低pH0.1%HCOOH吗啡-6β-D-葡萄糖醛苷1.10-羟基吗啡2.吗啡-3β-D-葡萄糖醛苷3.吗啡-6β-D-葡萄糖醛苷4.吗啡%24,56吗啡N-oxide©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation205.吗啡N-oxide6.6-乙酰吗啡Minutes0.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.403.603.800136-乙酰吗啡XBridge：基于第二代杂化颗粒技术BEHg(BridgedEthyleneHybrid)硅氧骨架中嵌入亚乙基桥-pH范围耐受更宽-机械强度更高-柱效佳©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation21Anal.Chem.2003,75,6781-6788U.S.PatentNo.6,686,035B2BEH第二代杂化颗粒为什么具有超强高pH耐受性？为什么具有超强高pH耐受性？硅胶颗粒OH-OH-OH©2009WatersCorporation|COMPANYCONFIDENTIAL©2012WatersCorporation©2012WatersCorporation22•仅需打断四个硅氧键即可腐蚀一个硅单位•须同时断裂六个键才可以去除经乙基桥键连接的两个硅单位(该过程极难发生)高pH色谱柱在方法开发中的优势二丁卡因（Dibucaine）(局部麻醉药碱性化合物)CH3O(局部麻醉药-碱性化合物)NNNCH3OH3C文献pKa=8.9SDS:表面活性剂/离子对试剂TEA:竞争碱为对抗峰拖尾而加入?ƒ美国药典USP24上所推荐的色谱方法ƒ淋洗剂:1.2g十二烷基磺酸钠(SDS),0.2g醋酸钠,2.0ml三乙基胺溶于300ml水中,调pH至5.6，然后加70