waters色谱讲座-液相色谱柱基础知识

Waters中国有限公司培训中心液相色谱教程(四)液相色谱柱基础知识Waters中国有限公司培训中心液相色谱柱基础知识(1)色谱柱及其填料©2004WatersCorporation高效液相色谱柱简介ƒ色谱柱是一根填满填料的管子ƒ柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽相同ƒ管内的填料更是种类繁多,主要分为两大类–硅胶基质–聚合物基质ƒ色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术©2004WatersCorporation硅胶的结构硅氧氢ƒ无定形的多孔基质－硅原子与氧原子彼此结合形成“硅氧键”=(Si–O–Si)©2004WatersCorporation液相色谱填料的合成(1)Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)ƒ传统硅胶颗粒基质ƒ合成步骤：–1.合成硅胶基质–2.键合配体(键合相)–3.端基封口©2004WatersCorporation未键合的硅胶颗粒:孔表面注意:表面硅醇基和微孔©2004WatersCorporation液相色谱填料的合成（2）键合相(配体)：C18残留硅羟基端基封口基团硅胶基质ƒ合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体(键合相)3.端基封口©2004WatersCorporation不同硅胶的制作过程ƒ硅酸钠沉淀：(无定形颗粒)-µBondapak™硅酸钠聚合成硅酸(硅胶)，之后研磨成小颗粒ƒ“SolGel”1过程:(球形颗粒)-Nova-Pak®胶态硅球被熔融入色谱颗粒中ƒ“SilGel”1过程:(球形颗粒)-Symmetry®纯硅烷聚合形成色谱颗粒©2004WatersCorporation硅胶颗粒技术的沿革ƒ六十年代薄膜无孔填料(表面积很低50m2/g--Corasil)ƒ七十年代无定形多孔填料10µm(WatersµBondapak™)ƒ八十年代球形填料5µm(WatersSpherisorb®及WatersNova-Pak®)ƒ1995年高纯球形填料3-5µm(WatersSymmetry)ƒ2000年无机硅胶和有机硅胶杂化填料-WatersXterra3.5µ,5µmƒ2004年小颗粒(1.7µm)杂化填料-WatersBEH（UPLC专用）©2004WatersCorporation对色谱柱填料的了解(一)ƒ平均颗粒度，颗粒度分布–颗粒度ƒ颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)–颗粒分布ƒ颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差)–颗粒形状ƒ球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀ƒ无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀谱带扩展©2004WatersCorporation硅胶颗粒的形状ƒ不规则形状(Irregular)–大硅胶颗粒研磨，筛分–颗粒尺寸和表面积限制ƒ球形（Spherical）–目前流行的分析填料–更好的性能，重现性©2004WatersCorporation对色谱柱填料的了解(二)ƒ键合相化学–影响化合物的分离度：α–不同键合相对不同种类的化合物分离不同–可能导致色谱的分离机理不同–如：C18、C8、CN©2004WatersCorporation键合相色谱柱ƒ以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相ƒ优点∶–固定相稳定，不易流失–应用广泛，可使用多种溶剂–消除硅羟基的不良影响ƒ缺点∶–pH值不能小于2(键合相水解)–同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同©2004WatersCorporation带有内嵌极性配体的色谱填料ƒWatersSymmetryShieldRP18…OSiCH3CH3PolarGroup内嵌极性基团配体OSiCH3CH3传统直链烷基配体(由一步合成过程而来)©2004WatersCorporation对色谱柱填料的了解(三)ƒ填料的端基封口–封口残余硅羟基–减少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）©2004WatersCorporation残基处理的效果①抗坏血酸②烟酰胺③对氨基苯甲酸④哌咯西叮⑤核黄素⑥苯酚⑦盐酸硫胺NovaPakC18未封口C18©2004WatersCorporation对色谱柱填料的了解(四)ƒ含碳量–含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）ƒ高含碳量–有利于不易保留的化合物的分离–水解稳定性好，重现性好–有利于极性化合物的拖尾改善ƒ低含碳量–有利于分析中性及碱性化合物–降低溶剂损耗©2004WatersCorporation不同色谱柱的含碳量色谱柱色谱柱C%C%kk'苊苊(50/50(50/50的乙腈的乙腈//水水))SymmetryC181917ZorbaxODS1715.7LiChrosorbRP-181510.3SymmetryC81212.5ResolveC-181212.4UltrasphereODS1111.3PartisilODS-31112.0µBondpakC-18107.9Nova-PakC-1875.5©2004WatersCorporation对色谱柱填料的了解(五)ƒ平均孔径/孔体积ƒ孔径/孔体积分布–大的孔径可分析高分子量的分子©2004WatersCorporation硅胶的孔结构无孔填料非常大300–1,000Å(30-100nm)10,000125-200Å(12.5-20nm)3,000–10,00060-130Å(6-13nm)3,000推荐使用的填料孔径被测物分子量(MW)ƒ孔占据大于99%的填料表面Si-OH=硅羟基（Silanol）注意：孔径是分布值©2004WatersCorporation硅胶的孔结构SiCH3H3CCH3OSiCCCCCCCCCCCCCCCCCCH3CCH3O25Å“立体位阻”ƒC18键合并端基封口后还能看见什么？硅羟基!—即使进行高密度键合，硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!封口基团©2004WatersCorporation对色谱柱填料的了解(六)ƒ硅胶的活性–主要影响碱性化合物的保留行为：k'–生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同–是选择性差异的主要来源ƒ硅胶的杂质含量–重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小–是色谱柱质量好坏的重要标志©2004WatersCorporation对色谱柱填料的了解(七)ƒ填料的pH稳定性–硅胶填料pH：2-8–聚合物填料pH：2-12–杂化硅胶填料pH：2-12ƒpH值小于2时键合相水解ƒpH值大于8时硅胶溶解123456789pH硅胶的溶解曲线©2004WatersCorporation对色谱柱填料的了解(八)ƒ填料的热稳定性–普通硅胶填料柱温:≤60℃–聚合物填料(高温GPC)柱温:≤150℃–杂化硅胶填料(XTerra)柱温:≤90℃©2004WatersCorporation色谱填料的热稳定性pH温度©2004WatersCorporation填料基质物理性质的影响ƒ填料基质的物理性质对色谱柱的影响–平均孔径及其分布:影响被分析样品的分子量，大孔径的可分析高分子量样品–平均孔体积及其分布:影响同孔径–含碳量:影响化合物的保留时间，高含碳量保留时间长–填料的端基封口:主要影响碱性化合物的峰形，未封口会使碱性化合物拖尾–硅胶的活性:主要影响碱性化合物的保留行为：K’，高活性的K’大–硅胶的杂质含量:更苛刻条件下的碱性化合物峰形©2004WatersCorporation液相色谱柱的分类ƒ从柱子类型上分：–分配/吸附，离子交换，凝胶，亲合ƒ从柱体积及柱结构上分：–内径：2.1mm以下(微径柱)、3.9mm~7.8mm(分析柱)、7.9mm~50mm（制备柱）–长度：5cm~60cmƒ从柱体材料上分∶–不锈钢（普通/可换柱芯）–玻璃–聚合物（径向加压）、PEEK©2004WatersCorporation色谱柱的规格ƒ内径–检测的灵敏度–样品的容量ƒ长度–分离度，理论塔板数–速度–样品的容量–检测的灵敏度©2004WatersCorporationWaters色谱柱的内径ƒWaters传统品牌的分析柱以3.9mm内径为主，比一般分析柱(4.6mm)细，因此：–相对灵敏度高–省溶剂，可用相对较低的流速–同样的流速下，柱压较高(高效柱尤为明显)ƒ注意在用文献方法时转换流速,即:降低流速,以保持线速度相同。©2004WatersCorporation色谱柱化学及外形与性能的关系液相色谱柱填料柱管颗粒表面性质颗粒度长度内径材料化学性质∶k，α分辨率机械因素∶N寿命，柱效，速度，溶剂消耗Waters中国有限公司培训中心液相色谱柱基础知识(2)色谱柱使用与保养©2004WatersCorporation色谱柱的连接ƒ各种锥箍和管路接头长度示意图:©2004WatersCorporation色谱柱的连接ƒStop_depth长度不合适造成柱前死体积–柱外扩散,造成色谱峰展宽正常死体积峰扩散©2004WatersCorporation色谱柱的连接ƒ锥箍锥度不合适造成渗漏©2004WatersCorporationWaters色谱柱的连接ƒWaters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英吋ƒSpherisorb品牌的色谱柱及PhaseSeparations公司的其它品牌色谱柱用的是“Parker-style”标，其stop-depth为0.090英吋ƒ连接Waters色谱柱昀好使用整体式PEEK工程塑料接头,(P/NPSL613315),耐压5000Psi;亦可适用于不同厂家的色谱柱与Waters仪器的连接©2004WatersCorporation测柱效-良好的色谱实验习惯ƒ拿到一根新色谱柱时，先测柱效ƒ保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件ƒ定期检测柱效ƒ定期检测仪器的谱带展宽©2004WatersCorporation测柱效的方法ƒ色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同ƒWaters的色谱柱均附有UseandCare说明书,可按说明书所述方法测定ƒ以下是Waters反相C18柱的测定方法:–流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min–样品:50mgAcenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮–进样量1–3μl–检测波长:254nm©2004WatersCorporation计算色谱柱的柱效Nƒ理论塔板数计算公式：Wσ方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3σ93σW4σ164σW5σ255σ21=WVNσ©2004WatersCorporation用“切线”法计算柱效18.70RV=plates874220.8018.70164N==σInjectInject16.63RV=plates95694N==268.063.1616σ不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来0.80W=0.68W=好柱坏柱©2004WatersCorporation用“5σ”法计算柱效7018.=RVplates82401.0318.7025N25==1.03W=height4.4%height4.4%plates3334N5==σ2441631625..6316.=RV1.44W=InjectInject好柱坏柱©2004WatersCorporation测量色谱系统的谱带展宽ƒ卸下色谱柱，用UNION(两通)代替之ƒ按测柱效方法，以1/10的样品浓度进样，大约2~5微升ƒ用5sigma方法测4.4%峰高处的峰宽：Wƒ仪器参数∶–流速∶1.0ml/min–检测器时间常数∶小于0.2ƒ谱带展宽（ml）=1000×W（min）©2004WatersCorporation色谱柱的正确使用及操作ƒ流动相的转换–特别是GPC柱ƒ流速(压力)的变化幅度ƒ温度的变化幅度ƒ专用色谱柱∶样品及溶剂的要求记住∶拿到一根从未用过的色谱柱时一定要先看其使用说明！©2004WatersCorporati